Terapias celulares genéticamente modificadas con nanopartículas lipídicas de ARNm para plaquetas transferibles
Las plaquetas transfectadas con ARNm utilizando LNP pueden expresar proteínas exógenas. (A) Esquema que describe la transfección de plaquetas utilizando ARNm-LNP. (B) Expresión de NanoLuc, medida como unidades relativas de luminiscencia (RLU) por proteína total, utilizando varios agentes de transfección (n =3). (C y D) Gráficos representativos de citometría de flujo y cuantificación de la intensidad de fluorescencia media (MFI) (barras, eje y izquierdo) y porcentaje de plaquetas (círculos rojos, eje y derecho) positivas para ARNm marcado con Cy5 (C) y marcador de activación plaquetaria CD62P (D). Las líneas discontinuas verticales representan la IMF y las flechas (arriba) representan la puerta para eventos positivos (n =3). Crédito:Avances científicos (2023). DOI:10.1126/sciadv.adi0508
Las transfusiones de plaquetas son esenciales para controlar el sangrado y la disfunción hemostática, y pueden ampliarse para usarse como terapia celular para una variedad de enfermedades. Los esfuerzos para crear este tipo de terapias celulares requieren que los investigadores modifiquen las plaquetas de los donantes para que expresen proteínas terapéuticas. Sin embargo, en la actualidad, los métodos apropiados para modificar genéticamente las plaquetas extraídas de donantes de sangre siguen siendo difíciles de alcanzar.
En un nuevo estudio publicado en Science Advances , Jerry Leung y un equipo de científicos en nanomedicina, bioquímica y biología molecular de la Universidad de Columbia Británica (Canadá), la Universidad de Hokkaido (Japón) y varias instituciones de EE. UU. describieron un enfoque basado en nanopartículas lipídicas optimizadas para plaquetas que contienen ARNm. para la expresión de proteínas exógenas en plaquetas humanas y de rata.
Cuando el equipo probó la biblioteca de nanopartículas de lípidos de ARNm, la expresión de proteínas exógenas resultante no se correlacionó con la activación plaquetaria. Las plaquetas transfectadas conservaron la función hemostática y se acumularon en áreas de daño vascular después de la transfusión en ratas con la capacidad de ampliar el potencial terapéutico de las plaquetas.
Plaquetas y hemostasia
Las plaquetas son parte integral de la hemostasia y se transfunden de forma rutinaria para restablecer el equilibrio hemostático en los pacientes. Estas plaquetas se pueden expandir más allá de indicaciones como terapias celulares para tratar la sepsis, la inflamación y la artritis. Las plaquetas genéticamente modificadas pueden crear nuevas terapias celulares que expresen proteínas terapéuticas, que pueden implementarse para modificar las plaquetas de los donantes. Los métodos existentes de electroporación, vectores virales y transfección comercial no han podido editar plaquetas de donantes ni expresar proteínas exógenas.
Los enfoques indirectos pueden expresar proteínas exógenas en plaquetas o partículas similares a plaquetas dirigiéndose a las células madre precursoras de plaquetas con vectores lentivirales. Las plaquetas derivadas de donantes deben modificarse funcionalmente para crear auténticas terapias con células plaquetarias.
Intentos anteriores de transfectar plaquetas con nanopartículas lipídicas que contienen ARNm han demostrado la posibilidad de administrar ARNm a las plaquetas, mientras que los avances en la tecnología de nanopartículas lipídicas han mejorado su potencial para llegar a un grupo demográfico más amplio.
En este trabajo, Leung y sus colegas informaron sobre las nanopartículas lipídicas de ARNm por su capacidad para transfectar directamente plaquetas de donantes para expresar proteínas exógenas. Estas plaquetas se pueden modificar con nanopartículas lipídicas de ARNm para mantener su función y acumularse localmente en las heridas y regular la homeostasis después de la transfusión en ratas coagulopáticas.
Las nanopartículas lipídicas facilitan la expresión de proteínas exógenas en las plaquetas
Para identificar los métodos de transfección eficaces para las plaquetas, el equipo entregó ARNm que codifica una enzima NanoLuc luciferasa (NanoLuc) utilizando varios agentes de transfección y midió su expresión. Si bien NanoLuc no se detectó en plaquetas tratadas con ARNm libre sin un agente de transfección o mediante el uso de agentes comerciales de administración de ARNm, el proceso permitió la absorción de grandes cantidades de ARNm en las plaquetas.
Leung y su equipo detectaron la expresión de NanoLuc mediante el uso de una formulación de nanopartículas de lípidos de ARNm que se parecía a la pequeña nanopartícula de lípidos de ARN de interferencia clínicamente probada para tratar la amiloidosis hereditaria. El equipo comparó la cantidad de activación plaquetaria después de la transfección de nanopartículas lipídicas de ARNm con plaquetas no tratadas.
Para identificar la formulación de nanopartículas lipídicas de ARNm más adecuada para transportar plaquetas, optimizaron tres componentes principales; lípidos ionizables, lípidos enlazadores y el lípido polietilenglicol. Examinaron 10 lípidos ionizables y dos catiónicos permanentes y midieron su expresión de proteínas, absorción de ARNm y activación para respaldar la síntesis de proteínas.