Los nematocistos son orgánulos punzantes de cnidarios que tienen propiedades mecánicas notables para sufrir cambios de volumen del 50 por ciento durante la exocitosis explosiva (proceso por el cual las células excretan desechos y moléculas grandes). mientras resiste presiones osmóticas superiores a 100 bar. Los investigadores habían identificado recientemente dos componentes proteicos novedosos que construyeron la pared del nematocisto en Hydra para incluir (1) una proteína-1 rica en prolina cnidario (CPP-1) con un motivo rígido de poliprolina, y (2) una Cnidoína elástica que posee un dominio similar a la seda. En un nuevo estudio, ahora en Informes científicos , Theresa Bentele y un equipo de investigadores de los departamentos de Medicina, Evolución Molecular y Genómica y el Instituto de Química Física en Alemania, Australia y Japón, expresó las proteínas Cnidoína y CPP-1 recombinantes en Escherichia coli .

Compararon el módulo elástico de las proteínas a granel reticuladas espontáneamente con el de los nematocistos aislados. Los investigadores optimizaron sistemáticamente la fabricación de nanofibras proteicas uniformes utilizando condiciones preparativas y de electrohilado. Ambas fibras se mantuvieron estables incluso después de un riguroso lavado e inmersión en agua a granel, debido a la reticulación simultánea de dominios ricos en cisteína. Las nanofibras resultantes eran claramente diferentes de otras nanofibras proteicas que eran inestables sin procedimientos químicos de reticulación. Después de la evaluación cuantitativa de las propiedades mecánicas, examinaron aplicaciones de nanofibras de cnidoína y CPP-1 para promover el crecimiento de células madre mesenquimales humanas.

Los hidra nematocistos comprenden cuatro variantes que se desarrollan en la columna corporal de pólipos en células especializadas conocidas como nematocitos. La extraordinaria dureza mecánica de la estructura de la pared de la cápsula hace que los nematocistos sean únicos para formar materiales bioinspirados en el laboratorio. La cápsula contiene complejos de proteínas reticulados por enlaces disulfuro intermoleculares entre dominios ricos en cisteína (CRD), que puede usarse como un reticulante versátil para crear polímeros lineales o ramificados entre diversas proteínas. Los científicos ya habían identificado dos nuevas proteínas en cápsula, incluidas CPP-1 y Cnidoin, mientras estudiaban los nematocistos de Hydra en su trabajo anterior. El potencial para combinar Cnidoína elástica y proteínas CPP-1 rígidas fue una estrategia prometedora para diseñar nuevos biomateriales capaces de formar estructuras estables con reticulación espontánea para lograr una flexibilidad y dureza excepcionales. similar a las cápsulas de nematocistos biológicos. Las nanofibras de proteínas sintéticas bioinspiradas han ganado una atención cada vez mayor como una matriz artificial para el cultivo de células madre para aplicaciones de ingeniería de tejidos. El electrohilado ofrece un método común para fabricar tales fibras utilizando proteínas de seda, colágeno y gelatina. Los productos de fibra fina tienen múltiples aplicaciones en la curación de heridas y la ingeniería de tejidos.

En el presente trabajo, Bentele y col. introdujo una nueva clase de nanofibras sintéticas libres de reticulantes basadas en las proteínas nematocistos de Hydra CPP-1 y Cnidoin usando electrohilado. Sobre la base de la capacidad de reticulación espontánea de los CRD, optimizaron sistemáticamente las condiciones preparativas para crear nanofibras de proteínas libres de reticuladores mediante bioingeniería que son estables bajo el agua con aplicaciones potenciales para el cultivo de células madre humanas. El equipo de investigación obtuvo imágenes de inmunofluorescencia representativas de una Hydra conjugada con anticuerpos CPP-1 (verde) y Cnidoína (rojo) para co-localizar las proteínas en la pared de la cápsula. Las imágenes indicaron la presencia de Cnidoin como más densamente empaquetada dentro de las paredes de nematocistos maduros en comparación con CPP-1. Después de eso, Bentele y col. usó métodos de transferencia Western para identificar las cápsulas de nematocistos nativas aisladas y las proteínas recombinantes (proteínas expresadas en otros organismos); que produjeron en E. coli. Los resultados indicaron modificaciones postraduccionales considerables de CPP-1 en Hydra. Confirmaron los resultados usando la proteína CPP-1 expresada en E. coli y dedujeron que tanto CPP-1 como Cnidoína eran proteínas estructurales de la pared del nematociste integradas durante la formación o morfogénesis.

Luego, los investigadores probaron las propiedades mecánicas de los nematocistos de Hydra y las proteínas a granel utilizando microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía de fuerza atómica (AFM). Los científicos extrajeron la distribución de los módulos elásticos y midieron además la elasticidad de la CPP-1 recombinante purificada (reCPP-1) y la Cnidoína (reCnidoína) expresada en E. coli. Luego optimizaron la producción de nanofibras mediante la introducción de polietilenglicol (PEG) de 900 kDa en la solución pura para obtener una mayor viscosidad del producto. El equipo investigó la influencia de la humedad relativa, que afectó significativamente la calidad de las nanofibras, mientras que la fuerza iónica o la conductividad de las soluciones de hilado no mostraron influencia sobre las nanofibras.

Basado en los resultados preliminares del desarrollo y caracterización de materiales, Bentele y col. nanofibras de proteína fabricadas mediante electrohilado de la solución de proteína-PEG en cubreobjetos de vidrio. Las nanofibras recCPP-1-PEG recién hiladas mostraron un ancho y una altura uniformes en una superficie de 50 x 50 µm. ² área y mostró un módulo elástico uniforme. Luego, el equipo midió la topografía de la superficie, obtuvo un mapa de elasticidad y una curva de fuerza-indentación característica para las nanofibras de reCPP-1 y reCnidoína (a) en el aire, (b) en el aire después de lavar con agua, y en (c) solución tampón fisiológica. Podían eliminar el PEG lavando con agua para obtener un grosor de fibra significativamente menor para las nanofibras de reCnidoína, aunque las dimensiones fueron menos pronunciadas en comparación con reCPP-1 después del tratamiento del agua.

Sin embargo, las fibras no se disolvieron por completo después de lavarlas con agua y retuvieron sus módulos elásticos. Los resultados sugieren que las dos proteínas recombinantes pueden establecer nanofibras estables mediante la formación espontánea de enlaces disulfuro entre los extremos de CRD (dominio rico en cisteína). Las proteínas de nematocistos de Hydra recombinantes producidas en este trabajo también formaron nanofibras uniformes y estables a través de las CRD de origen natural en el aire y en el tampón fisiológico. El equipo examinó las aplicaciones de estas nanofibras con cultivo estable de células madre mesenquimales humanas durante 20 días de incubación. durante el cual aproximadamente el 95 por ciento de las células mostró crecimiento celular y viabilidad en los nuevos materiales bioinspirados.

De este modo, Theresa Bentele y sus colegas propusieron un nuevo biomaterial de nanofibras sintéticas sin reticulantes, bioinspirado por las proteínas de la cápsula de nematocistos de Hydra. Expresaron proteínas recombinantes de dos proteínas de la cápsula de nematocistos CPP-1 y Cnidoína identificadas recientemente dentro de E. coli y prepararon nanofibras mediante electrohilado. Como resultado de los dominios ricos en cisteína (CRD), las fibras electrohiladas podrían reticularse espontáneamente mediante enlaces disulfuro. Las proteínas recombinantes reCPP-1 y reCnidoína formaron nanofibras uniformes que eran estables en agua directamente después del electrohilado. Las nuevas construcciones de materiales demostraron potencial como materiales biocompatibles inspirados en la estructura resistente y elástica del nematocistos Hydra.

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