A veces, los métodos de la vieja escuela proporcionan las mejores formas de estudiar la tecnología de vanguardia y sus efectos en el mundo moderno.

Dar un nuevo papel a una técnica de laboratorio de 65 años, Los investigadores del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) han realizado la separación más limpia hasta la fecha de nanopartículas sintéticas de un organismo vivo. Se espera que el nuevo método NIST mejore significativamente los experimentos que analizan los posibles impactos ambientales y de salud de estas entidades fabricadas. Permitirá a los científicos contar con mayor precisión cuántas nanopartículas realmente han sido ingeridas por organismos expuestos a ellas.

Un artículo que describe el nuevo método aparece en el número actual de la revista. ACS Nano .

La lombriz intestinal común Caenorhabditis elegans se ha utilizado en los últimos años como modelo vivo para estudios de laboratorio sobre cómo los compuestos biológicos y químicos pueden afectar a los organismos multicelulares. Estos compuestos incluyen nanopartículas de ingeniería (ENP), pedazos de material entre 1 y 100 nanómetros (mil millonésimas de metro, o alrededor de 1/10, 000 el diámetro de un glóbulo rojo). Las investigaciones anteriores a menudo se han centrado en cuantificar la cantidad y el tamaño de las nanopartículas diseñadas ingeridas por C. elegans. La medición de las nanopartículas que realmente se convierten en un organismo se considera un indicador más relevante de toxicidad potencial que solo la cantidad de ENP a los que están expuestos los gusanos.

Los métodos tradicionales para contar las PE ingeridas han producido resultados cuestionables. En la actualidad, los investigadores exponen C. elegans a ENP metálicos como plata u oro en solución, luego enjuague el exceso de partículas con agua seguido de centrifugación y liofilización. Una parte de la muestra "limpia" producida se examina normalmente mediante una técnica que determina la cantidad de metal presente. conocido como espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS). A menudo produce recuentos de ENP de decenas de miles por gusano; sin embargo, esos números siempre parecen demasiado altos para los investigadores del NIST que trabajan con C. elegans.

"Dado que ICP-MS detectará todas las nanopartículas asociadas con los gusanos, tanto los ingeridos como los que permanecen adheridos externamente, sospechamos que esto último es lo que hace que los recuentos de 'ENP' por gusano sean tan altos, "dijo la química analítica del NIST Monique Johnson, el autor principal del artículo ACS Nano. "Dado que solo queríamos cuantificar los ENP ingeridos, se necesitaba un método de separación más robusto y fiable ".

Afortunadamente, la solución al problema ya estaba en el laboratorio.

En el curso del cultivo de C. elegans para experimentos de exposición a ENP, Johnson y sus colegas habían utilizado la centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, un sistema establecido desde hace décadas para separar limpiamente los componentes celulares, para aislar los gusanos de los desechos y las bacterias. "Nos preguntamos si el mismo proceso nos permitiría realizar también una separación de organismo de ENP, así que diseñé un estudio para averiguar "Dijo Johnson.

En su experimento, los investigadores del NIST primero expusieron muestras separadas de C. elegans a concentraciones bajas y altas de dos tamaños de nanoesferas de oro, 30 y 60 nanómetros de diámetro. Los investigadores colocaron cada una de las muestras en una centrífuga y eliminaron el sobrenadante (porción líquida), dejando los gusanos y los ENP en los gránulos restantes. Estos se centrifugaron dos veces en una solución salina (en lugar de solo agua como en los métodos de separación anteriores), y luego centrifugado de nuevo, Pero esta vez, a través de un gradiente de densidad de sacarosa de diseño exclusivo.

"De arriba a abajo, nuestro gradiente consistió en una capa de solución salina para atrapar el exceso de ENP y tres capas cada vez más densas de sacarosa [20, 40 y 50 por ciento] para aislar C. elegans, "Johnson explicó." Seguimos el gradiente con tres enjuagues de agua y con centrifugaciones para asegurarnos de que solo los gusanos con ENP ingeridos, y no el medio de separación de sacarosa con ningún exceso de ENP, lo convertiría en el pellet final ".

El análisis del rango de masas en las muestras ultrapurificadas indicó niveles de oro más en línea con lo que los investigadores esperaban que se encontraran como ENP ingeridos. La validación experimental del éxito del método de separación NIST se produjo cuando los gusanos se examinaron en detalle bajo un microscopio electrónico de barrido (SEM).

"Para mi, El momento eureka fue cuando vi por primera vez ENP de oro en las imágenes de sección transversal tomadas de las muestras de C. elegans que se habían procesado a través del gradiente de densidad de sacarosa. ", Dijo Johnson." Había estado soñando con encontrar ENP en el tracto digestivo de la lombriz y ahora realmente estaban allí ".

Las imágenes SEM de alta resolución también proporcionaron evidencia visual de que solo se contaron los ENP ingeridos. "No se adhirieron ENP a la cutícula, el exoesqueleto de C. elegans, en cualquiera de las muestras de gradiente de densidad de sacarosa, ", Dijo Johnson." Cuando examinamos los gusanos de nuestros experimentos de control [procesados ​​utilizando el tradicional sin gradiente, método de separación con solo enjuague con agua], se encontraron varias nanoesferas adheridas a la cutícula.

Ahora que se ha demostrado con éxito, los investigadores del NIST planean perfeccionar y validar aún más su sistema para evaluar la captación de ENP por C. elegans. "Ojalá, Nuestro método se convertirá en una herramienta útil y valiosa para reducir la variabilidad de la medición y el sesgo de muestreo que pueden afectar a los estudios de nanotoxicología ambiental. "Dijo Johnson.