Luminiscencia de UCNP. a, Esquema de conversión ascendente de transferencia de energía con Yb3 + como sensibilizador y Er3 + como emisor. B, Intensidades de excitación máximas mínimas de la luz NIR necesarias para la obtención de imágenes multifotónicas de una sola molécula de varias clases de sondas luminiscentes. Los rangos de intensidad de excitación máxima que se muestran son necesarios para detectar señales de 100 c.p.s. Crédito:Cortesía de Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, y P. James Schuck, La Fundición Molecular, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley
Cuando se toman imágenes a nivel de una sola molécula, Se hacen evidentes pequeñas irregularidades conocidas como heterogeneidades, características que se pierden en la denominada imagen de conjunto. Al mismo tiempo, Hasta hace poco, ha sido un desafío desarrollar sondas luminiscentes con la fotoestabilidad, brillo y emisión continua necesarios para la microscopía de una sola molécula. Ahora, sin embargo, científicos de la Fundición Molecular del Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley, Berkeley, CA ha desarrollado conversión ascendente de nanopartículas (UCNP) de menos de 10 nm de diámetro cuyo brillo bajo imágenes de una sola partícula excede el de los materiales existentes en más de un orden de magnitud. Los investigadores afirman que sus hallazgos hacen posible una variedad de aplicaciones, incluyendo celular y en vivo imagen además de informar sobre las propiedades electromagnéticas locales de campo cercano de nanoestructuras complejas.
El Dr. P. James Schuck discutió el documento que él, Dr. Bruce E. Cohen, Dr. Daniel J. Gargas, Dr. Emory M. Chan, y sus coautores publicados en Nanotecnología de la naturaleza , comenzando con los principales desafíos que los científicos encontraron en:
"Los emisores más comunes que se utilizan para la obtención de imágenes de una sola molécula (tintes orgánicos y puntos cuánticos) tienen limitaciones significativas que han demostrado ser extremadamente difíciles de superar. "Schuck le dice a Phys.org. Él explica que los tintes orgánicos son generalmente las sondas más pequeñas (típicamente ~ 1 nm de tamaño), y se encenderá y apagará aleatoriamente. Este "parpadeo" es bastante problemático para las imágenes de una sola molécula, él continúa, y típicamente después de emitir aproximadamente 1 millón de fotones siempre foto blanqueador - es decir, apagar permanentemente. "Esto puede parecer una gran cantidad de fotones al principio, "Schuck dice, "pero esto significa que los tintes dejan de emitirse después de sólo entre 1 y 10 segundos en la mayoría de las condiciones de obtención de imágenes. Los UCNP nunca parpadean".
Es más, Schuck continúa, resulta que existen los mismos problemas para los puntos cuánticos fluorescentes, o Qdots , así como. Sin embargo, si bien es posible hacer Qdots que no parpadeen ni se decoloren, esto generalmente requiere la adición de capas al Qdot, lo que los hace demasiado grandes para muchas aplicaciones de imágenes. (Un punto cuántico es un nanocristal semiconductor lo suficientemente pequeño como para exhibir propiedades mecánicas cuánticas). "Nuestros nuevos UCNP son pequeños, y no parpadear ni blanquear ".
Debido a estas propiedades, él nota, Las UCNP han generado recientemente un interés significativo porque tienen el potencial de ser etiquetas y sondas luminiscentes ideales para imágenes ópticas, pero el principal obstáculo para realizar su potencial había sido la incapacidad de diseñar UCNP de menos de 10 nm lo suficientemente brillantes como para ser fotografiadas en un solo punto. Nivel UCNP.
Intensidad y heterogeneidad de luminiscencia dependientes del tamaño de UCNP. a, Desviación de la intensidad de luminiscencia de UCNP simple normalizada al volumen de partículas de la escala volumétrica ideal (n¼300 en total). La curva representa la intensidad calculada normalizada al volumen para UCNP con una capa superficial no luminiscente de 1,7 nm. Solo intensidades de soltero, nanocristales no agregados, según lo determinado por la Fig.5 complementaria, son usados. El recuadro superior muestra un diagrama que representa un nanocristal ideal en el que todos los emisores incluidos son luminiscentes (círculos verdes). El recuadro inferior es un diagrama que representa un nanocristal con emisores que no son luminiscentes (círculos marrones) en una capa de la superficie exterior. B, Espectros finos de las bandas de emisión verde recogidos de cuatro UCNP individuales de 8 nm (curvas 1-4) y sus espectros promediados (curva Sigma). Crédito:Cortesía de Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, y P. James Schuck, La Fundición Molecular, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley
"Esto me lleva a lo que probablemente sea el punto más importante de nuestro trabajo, que es el descubrimiento y demostración de nuevas reglas para diseñar ultrabrillantes, sondas de una sola molécula UCNP ultrapequeñas, "Dice Schuck. Además, enfatiza que estas nuevas reglas contrastan directamente con los métodos convencionales para crear UCNP brillantes. "Como mostramos en nuestro artículo, ¡Sintetizamos y obtuvimos imágenes de UCNP tan pequeñas como una sola proteína fluorescente! Para muchas aplicaciones de bioimagen, Se requieren sondas luminiscentes muy pequeñas, ciertamente menores de 10 nm, porque realmente se necesita la etiqueta o la sonda para perturbar el sistema que están probando lo menos posible ".
Schuck menciona otra ventaja de la conversión ascendente de nanopartículas, a saber, operan absorbiendo dos o más fotones infrarrojos y emitiendo luz visible de mayor energía. "Dado que casi todos los demás materiales no se convierten, al obtener imágenes de los UCNP en una muestra, casi no hay otro fondo autofluorescente que se origine en la muestra. Esto da como resultado un buen contraste de imagen y grandes niveles de señal a fondo ". Además, mientras que los tintes orgánicos y Qdots también pueden absorber luz IR y emitir luz de mayor energía a través de un proceso de absorción de fotones no lineal de dos +, los poderes de excitación necesarios para generar señales de fluorescencia de dos fotones medibles en tintes y pequeños Qdots son muchos órdenes de magnitud más altos que los necesarios para generar luminiscencia de conversión ascendente a partir de UCNP. "Estos altos poderes son generalmente malos para las muestras y una gran preocupación en las comunidades de bioimagen" enfatiza Schuck, "donde pueden provocar daños y muerte celular".
Schuck señala que otros dos aspectos clave fundamentales para los descubrimientos mencionados en el documento:el uso de la caracterización avanzada de una sola partícula, y modelado teórico - fueron una consecuencia del entorno colaborativo multidisciplinario en Foundry. "Este estudio nos obligó a combinar la fotofísica de una sola molécula, la capacidad de sintetizar nanocristales de conversión ascendente ultrapequeños de casi cualquier composición, y el modelado y simulación avanzados de propiedades ópticas UCNP, ", dice." Simular y modelar con precisión el comportamiento fotofísico de estos materiales es un desafío debido a la gran cantidad de niveles de energía en estos materiales que interactúan de manera compleja, y Emory Chan ha desarrollado un modelo único que representa objetivamente todos los más de 10, 000 transiciones de colector a colector en el rango de energía permitido ".
Previamente, Schuck dice que la sabiduría convencional para diseñar UCNP brillantes había sido utilizar una concentración relativamente pequeña de iones emisores en las nanopartículas, ya que demasiados emisores conducirán a un brillo más bajo debido a los efectos de auto-extinción una vez que la concentración del emisor UCNP exceda ~ 1%. "Esto resulta ser cierto si desea crear partículas que sean brillantes en condiciones de imagen de conjunto, es decir, donde se usa una potencia de excitación relativamente baja, ya que tiene muchas partículas señalizando colectivamente, "Explica Schuck." Sin embargo, esto se descompone en condiciones de obtención de imágenes de una sola molécula ". En su artículo, Los investigadores han demostrado que bajo los mayores poderes de excitación utilizados para obtener imágenes de partículas individuales, los niveles de energía relevantes se saturan más y se reduce el autoapagamiento. "Por lo tanto, "Schuck continúa, "desea incluir en sus UCNP la mayor concentración posible de iones emisores". Esto da como resultado que las nanopartículas sean casi no luminiscentes en condiciones de conjunto de baja potencia de excitación debido a un autoapagado significativo. pero ultrabrillante en condiciones de formación de imágenes de una sola molécula.
Configuración experimental para caracterización óptica UCNP única. Un láser de 980 nm se enfoca previamente con una lente de 500 mm antes de ingresar a la apertura posterior de un objetivo 0.95 NA 100x (Zeiss), que ajusta el plano focal del láser más cerca del de la luminiscencia visible (línea discontinua). La luz emitida se recupera a través del mismo objetivo, filtrado por dos filtros de paso corto de 700 nm y dos filtros de paso largo de 532 nm (Chroma) para eliminar la luz láser residual, y enfocado en un solo APD de conteo de fotones (MPD) o enrutado a un espectrómetro CCD refrigerado por LN (Princeton Instruments) con rejilla de 1200 ranuras / mm. Se utiliza un contador de fotón único correlacionado en el tiempo (Picoquant) para las mediciones de la vida útil de la luminiscencia. Todos los experimentos se realizaron en condiciones ambientales a 106 / cm2 a menos que se indique lo contrario. Los datos dependientes de la potencia y los cortes de línea de una sola partícula que se muestran en la Fig. 4 se recopilaron con un objetivo de inmersión en aceite 1.4 NA 100x (Nikon). Crédito:Cortesía de Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, y P. James Schuck, La Fundición Molecular, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley
Otra implicación importante de este hallazgo, Schuck agrega, es que debería cambiar la forma en que la gente buscará las mejores sondas luminiscentes de molécula única en el futuro. "Hasta ahora, "señala, "la gente primero miraría para ver qué sondas eran brillantes usando condiciones de nivel de conjunto, luego investigaría solo ese subconjunto como posibles sondas de una sola molécula. Nuestras nuevas sondas por supuesto, ¡Han fallado esa prueba de detección! "
Schuck enfatiza nuevamente que "una razón clave por la que ocurrió este descubrimiento es que tenemos expertos en todas las áreas clave en el mismo edificio, y pudimos iterar rápidamente a través del ciclo teoría-síntesis-caracterización ".
Con respecto a las direcciones de investigación futuras, señala Schuck, los científicos están siguiendo algunas vías diferentes. "Ciertamente nos gustaría utilizar ahora estos UCNP de nuevo diseño para la obtención de imágenes biológicas ... hasta ahora, solo hemos investigado las propiedades fotofísicas fundamentales de estas partículas cuando están aisladas en vidrio. Creemos que una aplicación interesante e importante será su uso en imágenes cerebrales, especialmente para tejidos profundos. en vivo Imágenes ópticas de neuronas y función cerebral.
Para concluir, Schuck menciona otras áreas de investigación que podrían beneficiarse de su estudio. "Creo que una aplicación principal es el seguimiento de una sola partícula dentro de las células. Por ejemplo, "ilustra, "etiquetar proteínas específicas con UCNP individuales y rastrearlas para comprender su cinética celular".
A lo largo de diferentes líneas, Schuck agrega, resulta que los UCNP también son excelentes sondas de campos electromagnéticos muy locales. "Esto se debe a que los lantánidos tienen un conjunto bastante único de propiedades fotofísicas, como la emisión de dipolos magnéticos relativamente prevalente, permitiéndonos sondear campos magnéticos ópticos, y vidas muy largas, de modo que las transiciones no están estrictamente permitidas, lo que nos permite sondear más fácilmente los efectos ópticos cuánticos de la cavidad, como la mejora de la emisión de Purcell. De hecho, Schuck concluye, un experimento que utiliza UCNP para informar sobre las intensidades de campo cercano y las distribuciones de campo que rodean a los dispositivos nanoplásmicos está recién en marcha ".
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