(Phys.org) - Investigadores del Instituto de Tecnología de Georgia y la Universidad de California en San Francisco tienen la capacidad de los científicos avanzados para ver una imagen clara de una sola estructura celular en movimiento. Al identificar moléculas mediante detección comprimida, este nuevo método proporciona la resolución espacial necesaria más una resolución temporal más rápida de lo que era posible anteriormente.

A pesar de muchos logros en el campo de la microscopía de superresolución en los últimos años con avances en resolución espacial, La obtención de imágenes de células vivas sigue siendo un desafío debido a la necesidad de una alta resolución temporal.

Ahora, Lei Zhu, profesor asistente en la Escuela de Ingeniería Mecánica George W. Woodruff de Georgia Tech, y Bo Huang, profesor asistente en el Departamento de Química Farmacéutica y el Departamento de Bioquímica y Biofísica de UCSF, han desarrollado un enfoque avanzado utilizando microscopía de superresolución para resolver las características celulares en un orden de magnitud más pequeño de lo que se podía ver antes. Esto permite a los investigadores aprovechar información previamente inaccesible y responder nuevas preguntas biológicas.

La investigación fue publicada el 22 de abril de 2012 en la revista Métodos de la naturaleza . La investigación está financiada por los Institutos Nacionales de Salud, Programa de UCSF para la investigación biomédica innovadora, Beca Searle y Beca Packard para ciencia e ingeniería.

La tecnología anterior que utiliza el enfoque de conmutación de una sola molécula para microscopía de superresolución depende de la difusión de imágenes de una sola molécula escasamente en muchas, a menudo miles de marcos de cámara. Es extremadamente limitado en su resolución temporal y no proporciona la capacidad de seguir procesos dinámicos en células vivas.

“Ahora podemos utilizar nuestro descubrimiento utilizando microscopía de superresolución con una resolución temporal de segundos o incluso subsegundos para que un gran campo de visión siga muchos procesos celulares más dinámicos, ”Dijo Zhu. "Gran parte de nuestro conocimiento de la vida de una célula proviene de nuestra capacidad para ver las pequeñas estructuras que contiene".

Huang señaló, "Una aplicación, por ejemplo, es investigar cómo las mitocondrias, la central eléctrica de la celda, interactuar con otros orgánulos y el citoesqueleto para remodelar la estructura durante el ciclo de vida de la célula ".

En la actualidad, microscopía de luz, especialmente en la forma moderna de microscopía de fluorescencia, todavía se utiliza con frecuencia por muchos biólogos. Sin embargo, los autores dicen, La microscopía óptica convencional tiene una limitación importante:la incapacidad de resolver dos objetos más cerca de la mitad de la longitud de onda de la luz debido al fenómeno llamado difracción. Con difracción, las imágenes se ven borrosas y superpuestas sin importar el aumento que se utilice.

“El límite de difracción se ha considerado durante mucho tiempo como una de las limitaciones fundamentales de la microscopía óptica hasta las recientes invenciones de las técnicas de microscopía de fluorescencia de superresolución, ”Dijo Zhu. Métodos de microscopía de superresolución, como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) o la microscopía de localización fotoactivada (PALM), dependen de la capacidad de registrar la emisión de luz de una sola molécula en la muestra.

Usando moléculas de sonda que se pueden cambiar entre un estado visible e invisible, STORM / PALM determina la posición de cada molécula de interés. Estas posiciones definen en última instancia una estructura.

El nuevo hallazgo es significativo, dijeron Zhu y Huang, porque han demostrado que la tecnología permite seguir la dinámica de un citoesqueleto de microtúbulos con una resolución de tiempo de tres segundos, lo que permitiría a los investigadores estudiar los transportes activos de vesículas y otras cargas dentro de la célula.

Utilizando el mismo sistema óptico y detector que en la microscopía óptica convencional, La microscopía de súper resolución naturalmente requiere más tiempo de adquisición para obtener más información espacial, lo que lleva a una compensación entre su resolución espacial y temporal. En los métodos de microscopía de superresolución basados ​​en STORM / PALM, cada imagen de la cámara muestrea un subconjunto muy escaso de moléculas sonda en la muestra.

Un enfoque alternativo es aumentar la densidad de los fluoróforos activados para que cada fotograma de la cámara muestree más moléculas. Sin embargo, esta alta densidad de manchas fluorescentes hace que se superpongan, invalidando el método de localización de una sola molécula ampliamente utilizado.

Los autores dijeron que recientemente se han informado varios métodos que pueden recuperar de manera eficiente posiciones de una sola molécula incluso cuando las señales de un solo fluoróforo se superponen. Estos métodos se basan en el ajuste de grupos de puntos superpuestos con un número variable de funciones de dispersión de puntos (PSF) con estimación de máxima verosimilitud o estadísticas bayesianas. El método bayesiano también se ha aplicado a todo el conjunto de imágenes.

Como resultado de una nueva investigación, Zhu y Huang presentan un nuevo enfoque basado en la optimización global utilizando sensores comprimidos, lo que no implica estimar o asumir el número de moléculas en la imagen. Demuestran que la detección comprimida puede funcionar con densidades de moléculas mucho más altas en comparación con otras tecnologías y demuestran imágenes de células vivas de microtúbulos marcados con proteínas fluorescentes con una resolución temporal de tres segundos.

El experimento STORM utilizado por los autores, con microtúbulos inmunoteñidos en células Drosophila melanogaster S2, demostró que los microtúbulos cercanos se pueden resolver mediante detección comprimida utilizando tan solo 100 fotogramas de cámara, mientras que no eran discernibles por el método de ajuste de una sola molécula. También han realizado STORM en vivo en células S2 que expresan de manera estable tubulina fusionada a mEos2.

A la frecuencia de cuadro de la cámara de uso común de 56,4 hercios, se construyó una película de superresolución con una resolución de tiempo de tres segundos (169 fotogramas) y una resolución de Nyquist de 60 nanómetros, mucho más rápido de lo que se informó anteriormente, dijeron Zhu y Huang. Estos resultados han demostrado que la detección comprimida puede permitir a STORM monitorear procesos celulares en vivo con una resolución de tiempo de segunda escala. o incluso resolución de escala inferior a un segundo si se puede utilizar una cámara más rápida.