Descripción general del sistema Miniscope3D. En comparación con los diseños anteriores de Miniscope y MiniLFM, nuestro Miniscope3D es más ligero y compacto. Quitamos la lente del tubo del Miniscope y colocamos una máscara de fase optimizada de 55 μm de espesor en el tope de apertura (plano de Fourier) de la lente del objetivo GRIN. Se captura un conjunto escaso (64 por profundidad) de funciones de dispersión de puntos de calibración (PSF) escaneando una perla fluorescente verde de 2,5 μm en todo el volumen. Usamos este conjunto de datos para precalcular un modelo directo eficiente que captura con precisión las aberraciones que varían en el campo. El modelo directo se utiliza luego para resolver iterativamente un problema inverso para reconstruir volúmenes 3D a partir de mediciones 2D de un solo disparo. La reconstrucción 3D aquí es de un tardígrado marcado con fluorescencia que nada libremente. Crédito:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-020-00403-7
Un microscopio de fluorescencia en miniatura que pese menos y ofrezca una alta resolución en comparación con los dispositivos existentes tendrá una variedad de aplicaciones en biología de sistemas. Los microscopios de fluorescencia en miniatura existentes son una técnica estándar en las ciencias de la vida, pero solo ofrecen información bidimensional (2-D). En un nuevo informe ahora en Nature Light:ciencia y aplicaciones , Kyrollos Yanny, Nick Antipa y un equipo de científicos del Programa Conjunto de Posgrado en Bioingeniería, Ingeniería Eléctrica y Ciencias de la Computación en la Universidad de California, Berkeley y la Université libre de Bruxelles Bélgica, desarrolló un microscopio de fluorescencia tridimensional de disparo único. Diseñaron el nuevo dispositivo conocido como Miniscope3D reemplazando la lente del tubo de un miniscopio 2-D convencional con una máscara de fase multifocal optimizada en el tope de apertura del objetivo. Usando el dispositivo, Yanny y Antipa et al. Actividad neuronal registrada ópticamente en animales que se mueven libremente y en aplicaciones de imágenes in situ a largo plazo en incubadoras y dentro de dispositivos de laboratorio en un chip.
Imágenes de fluorescencia en miniatura e innovaciones técnicas
Los microscopios de fluorescencia en miniatura son importantes en la biología de sistemas para las grabaciones ópticas de la actividad neuronal en animales que se mueven libremente, Imágenes in situ a largo plazo en incubadoras y dispositivos médicos. Estos microscopios también se conocen como "miniscopios" y están hechos de piezas impresas en 3-D, aunque ofrece imágenes de fluorescencia 2-D solo. Los métodos de disparo único pueden permitir velocidades de captura más rápidas y una resolución temporal limitada por la velocidad de fotogramas de la cámara. Por ejemplo, Un microscopio de campo de luz en miniatura desarrollado previamente (MiniLFM) puede procesar la actividad neuronal con un algoritmo optimizado. En este trabajo, Yanny y col. desarrolló un miniscopio 3-D para lograr una resolución más alta con un peso más liviano en comparación con las técnicas existentes. El equipo probó las capacidades microscópicas mediante la obtención de imágenes de objetivos de resolución fluorescente, así como muestras biológicas que nadan libremente y tejido cerebral de ratón. Ellos validaron los resultados reconstruidos en comparación con la microscopía de dos fotones para comprender los límites de la nueva técnica.
Fabricación de máscara de fase con nanoscribe. (a) La costura rectangular conduce a costuras (líneas negras) que atraviesan las muchas microlentes, mientras que la costura adaptativa coloca las costuras en los límites de las microlentes para mitigar los artefactos. (b) Comparación entre PSF diseñadas y experimentales a unas pocas profundidades de muestra, mostrando buen acuerdo, con ligera degradación en el borde del volumen. Crédito:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-020-00403-7
Para lograr imágenes de alta calidad en un pequeño, dispositivo de bajo peso, Yanny y col. colocó la máscara de fase (donde la luz que pasa a través de la máscara experimentará un cambio de fase proporcional al grosor del material) en el espacio de Fourier para reducir la carga computacional y mejorar la compacidad. Agregaron capacidades 3-D al miniscopio 2-D a costa de una pequeña pérdida en la resolución lateral y una menor relación señal-ruido. El algoritmo unió la teoría óptica con la detección comprimida para fabricar las máscaras de fase optimizadas. La técnica facilitó una nueva arquitectura de microscopio 3D en miniatura con mayor resolución, diseños de código abierto, Fabricación de mayor calidad y un esquema de calibración o algoritmo de reconstrucción eficiente.
Caracterizar el microscopio computacional e investigar el cerebro del ratón
El equipo probó el rendimiento del microscopio computacional utilizando muestras de complejidad creciente para capturar grabaciones dinámicas 3-D. Midieron la resolución lateral a diferentes profundidades obteniendo imágenes de un objetivo de resolución fluorescente. Luego validaron la precisión de sus resultados utilizando microscopía de dos fotones. Por ejemplo, el Miniscope3D pudo recuperar con precisión todas las imágenes reconstruidas del posprocesamiento de la muestra de perlas fluorescentes 3-D. Demostraron el potencial del método utilizando muestras neurobiológicas donde las regiones etiquetadas con proteína fluorescente verde expresaban poblaciones escasas de neuronas en toda la muestra. Las imágenes reconstruidas obtenidas de diferentes partes del hipocampo mostraron dendritas corriendo por la superficie junto con cuerpos celulares individuales. Cuando Yanny et al. A continuación investigó muestras dinámicas de natación libre, tardígrados teñidos de verde (también conocidos como osos de agua), Las imágenes reconstruidas mostraron la eficiencia de las imágenes Miniscope3D para rastrear organismos biológicos que se mueven libremente a alta resolución en el espacio-tiempo.
Caracterización experimental. (a) Reconstrucciones de un objetivo USAF fluorescente en diferentes posiciones axiales para determinar la resolución lateral dependiente de la profundidad. Recuperamos una resolución de 2,76 μm en la mayor parte del rango de profundidades de 390 μm, con el peor de los casos de 3,9 μm (las líneas naranjas discontinuas marcan las ubicaciones insertadas, y los recuadros amarillos en los recuadros indican los grupos resueltos más pequeños). Tenga en cuenta que el objetivo de resolución tiene niveles discretos de resolución que dan como resultado saltos en los datos y que la resolución aquí se refiere al espacio entre barras, no el ancho del par de líneas. (b) Reconstrucción de una muestra de 160 μm de espesor de perlas fluorescentes de 4,8 μm en comparación con una imagen de escaneo 3D de dos fotones (se muestran las proyecciones de intensidad máxima en los planos yx y zx). Nuestro sistema detecta las mismas características, con un tamaño de mancha lateral ligeramente mayor. Crédito:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-020-00403-7
Reconstrucción de neuronas marcadas con GFP en una rebanada de cerebro de ratón de 300 µm de grosor con depuración óptica que demuestra la resolución de una sola neurona y dendritas claramente resueltas que recorren el volumen axialmente. Crédito:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-020-00403-7
Reconstrucción tridimensional de tardígrados que nadan libremente. (Izquierda) Datos brutos. (Derecha) Reconstrucción de tardígrados teñidos de verde SYBR que se mueven libremente. Crédito:Crédito:Luz:Ciencia y Aplicaciones, doi:10.1038 / s41377-020-00403-7
Aplicaciones y accesibilidad del dispositivo
La mayoría de las aplicaciones de Miniscope3D serán similares a la microscopía 3D y MiniLFM (microscopía de campo de luz en miniatura), que se considera el estándar de oro para imágenes de fluorescencia tridimensional en miniatura de un solo disparo. En comparación con MiniLFM, sin embargo, el nuevo método Miniscope3D ofreció múltiples mejoras, incluidas lentes multifocales, en el mejor de los casos, resolución lateral y un aumento de 10 veces en el volumen de medición utilizable. El rendimiento mejorado llegó en un paquete de hardware más pequeño que el MiniLFM con un peso más liviano para observar libremente los organismos en movimiento. El método permitió además la reconstrucción experimental con o sin dispersión para tejido cerebral de ratón con resolución de una sola neurona. El equipo optimizará los límites existentes del dispositivo, incluida la dispersión, para otras aplicaciones.
Al construir sobre una popular plataforma de miniscopios de código abierto, Yanny y col. proporcionó accesibilidad para el diseño Miniscope3D. De este modo, Kyrollos Yanny, Nick Antipa y sus colegas proporcionaron un prototipo 3-D como una oportunidad para actualizar los miniscopios 2-D que se utilizan actualmente en 450 laboratorios. Los resultados experimentales concordaron bien con el diseño teórico y el análisis para servir como un marco útil para los sistemas 3D personalizados de un solo disparo.
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