a, Un rayo láser colimado se envía a la instalación mediante un divisor de haz (BS) y a un espejo de escaneo galvanométrico (GSM), que se refleja en el plano focal posterior de un objetivo aéreo (OBJ1). Al escanear el GSM, se traza el enfoque en una dimensión, como lo muestra la flecha de dos puntas en el espacio focal frontal encuadrado del OBJ1. Un espejo retrovisor refleja la luz con diferentes cantidades de desenfoque hacia el objetivo, que luego viaja a través de las lentes hacia el GSM, donde es desescaneado por, que elimina el movimiento de exploración lateral y solo queda el componente axial. A continuación, se vuelve a visualizar el GSM en el plano focal posterior de un objetivo de inmersión en agua (OBJ2). OBJ2 forma una imagen libre de aberraciones del foco (formada por OBJ1) en el espacio muestral. B, Ampliada la vista de la región encuadrada desde a. El panel de la izquierda muestra el enfoque de la luz en su enfoque nominal. Las flechas negras muestran los rayos marginales que regresan después de la reflexión. Cada paso en el espejo da como resultado un punto de enfoque en el plano de la muestra con una posición axial desplazada. C, Configuración alternativa con espejo inclinado que permite un escaneo axial continuo. Aquí, el objetivo remoto OBJ1 se desplaza ligeramente fuera del eje óptico para crear un enfoque inclinado que es normal a la superficie del espejo. Escanear este enfoque lateralmente da como resultado un cambio de enfoque, como lo ilustran las flechas negras Crédito:Tonmoy Chakraborty, Bingying Chen, Stephan Daetwyler, Bo-Jui Chang, Oliver Vanderpoorten, Etai Sapoznik, Clemens Kaminski, Tuomas P.J. Knowles, Kevin M. Dean, y Reto Fiolka
En microscopía óptica, La obtención de imágenes volumétricas de alta velocidad está limitada por la velocidad de exploración axial lenta o por las aberraciones introducidas por el mecanismo de exploración z. Para superar estas limitaciones, Los científicos de UT Southwestern han introducido un novedoso diseño óptico que transforma un movimiento de barrido lateral en un barrido en la tercera dimensión. Su microscopio realizó un enfoque láser a una velocidad de 12 kHz y permitió la observación de la dinámica rápida dentro de las células y el corazón latiendo en los embriones de pez cebra.
La obtención de imágenes rápidas es de gran interés en microscopía, visión por computador, y mecanizado láser. Por ejemplo, en neurociencia, La obtención de imágenes volumétricas de alta velocidad es esencial para monitorear los procesos biológicos dinámicos, incluida la actividad de voltaje de la membrana (con dinámica en la escala de tiempo de 1 ms o menos) o el flujo sanguíneo cerebral. La rapidez con la que se puede obtener una imagen está estrechamente relacionada con la rapidez con la que se puede cambiar la posición del foco del sistema de imágenes, particularmente en la tercera dimensión.
Las formas tradicionales de reenfocar lo hacen moviendo mecánicamente el objetivo del microscopio o la muestra, lo que conduce a una baja velocidad de exploración en la tercera dimensión, ya que la velocidad de los objetos físicos en movimiento está limitada por la inercia. Una forma potencial de aliviar este problema es mediante el enfoque remoto, que realiza el reenfoque cambiando el frente de onda del sistema óptico. Sin embargo, la mayoría de las tecnologías existentes enfrentan el compromiso entre resolución y velocidad. Como tal, Sigue existiendo la necesidad de una tecnología de escaneo 3-D capaz de alcanzar velocidades de varios kHz y evitar aberraciones que reducirían su resolución.
En un manuscrito publicado en Ciencias de la luz y aplicaciones , un equipo de científicos, dirigido por el profesor Reto Fiolka del Departamento de Biología Celular y el Departamento de Bioinformática de Lyda Hill, en UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, ESTADOS UNIDOS., y compañeros de trabajo han desarrollado un diseño óptico novedoso para superar estos desafíos. Emplearon tecnologías de escaneo lateral bien establecidas y transformaron el movimiento de escaneo lateral en un reenfoque en la tercera dimensión para obtener imágenes volumétricas de alta velocidad. Tomaron el concepto de enfoque remoto sin aberraciones, y en lugar de mover un espejo remoto correspondiente en la tercera dimensión, escanearon un punto láser lateralmente con un galvanómetro de alta velocidad sobre un espejo fijo. Si la distancia entre el espejo estacionario y la lente del objetivo no es constante a lo largo de la dirección de escaneo, se introducirá un desenfoque según sea necesario para el reenfoque remoto. Es más, en el camino de regreso, el componente de exploración lateral está perfectamente compensado, de modo que se obtenga un movimiento de exploración puro en la tercera dimensión. De este modo, los investigadores pudieron aprovechar las tecnologías de barrido lateral de alta velocidad para mover rápidamente un foco láser de alta resolución en la tercera dimensión.
a, Nanopartículas multiméricas codificadas genéticamente dentro de dos células MV3, según la imagen de ASLM en un tiempo de integración de imágenes de 20 ms, y 3,57 volúmenes por segundo. B, Vista YZ de la región perinuclear. Los círculos amarillos indican vesículas detectadas y las líneas azules ilustran huellas acumulativas. C, Dibujo esquemático del embrión de pez cebra. D, Sección transversal XZ promediada (más de 30 ciclos) del corazón de pez cebra, adquirido con una velocidad de fotogramas de 45 Hz. mi, Kymograph de corazón palpitante, medido a lo largo de la línea que se muestra en d. Kymograph utiliza datos sin procesar y no se aplicó ningún promedio. F, Imágenes volumétricas de un corazón de pez cebra a una frecuencia de volumen de 7,4 Hz, Vista XY con profundidad codificada en color. Barra de escala, a, 10 micrones; B, 1 micrones; D, e 20 micrones Crédito:Tonmoy Chakraborty, Bingying Chen, Stephan Daetwyler, Bo-Jui Chang, Oliver Vanderpoorten, Etai Sapoznik, Clemens Kaminski, Tuomas P.J. Knowles, Kevin M. Dean, y Reto Fiolka
Dos implementaciones que utilizan un espejo escalonado y un espejo plano inclinado, fueron adoptados para realizar este concepto. El primero permite tamaños de pasos axiales arbitrariamente grandes en un número finito de pasos, y este último permite un número y tamaño arbitrarios de pasos axiales y es capaz de escanear continuamente en la tercera dimensión, aunque en un rango de escaneo más limitado. Con las dos implementaciones, los científicos introducen aplicaciones de esta tecnología:
"Nuestra primera demostración práctica sobre imágenes microscópicas fue la aceleración de la microscopía de hoja de luz de barrido axial (ASLM), que ha sido criticado por su lenta velocidad de adquisición (alrededor de 10 Hz de velocidad de fotogramas en implementaciones de alta resolución, previamente). Nuestra nueva tecnología de escaneo permite una aceleración de un orden de magnitud mientras mantiene el alto poder de resolución espacial de esta tecnología emergente de imágenes. En una segunda aplicación, implementamos nuestra tecnología de escaneo en un microscopio de escaneo ráster de 2 fotones y realizamos imágenes volumétricas de alta resolución con una tasa de escaneo en la tercera dimensión de 12 kHz. En efecto, a esta resolución espacial, Nuestro enfoque es 6 veces más rápido que las tecnologías de enfoque sin aberraciones informadas anteriormente. Luego demostramos el potencial de nuestra tecnología para la microscopía intravital mediante la obtención de imágenes del corazón palpitante de un embrión de pez cebra. Creemos que esto abre grandes aplicaciones para la obtención de imágenes intravitales, especialmente en las neurociencias ".
"Tanto las tecnologías de escaneo discreto como continuo pueden encontrar muchas aplicaciones para obtener imágenes de diferentes capas del cerebro casi simultáneamente o para adquirir rápidamente volúmenes completos para medir los patrones de activación neuronal o el flujo sanguíneo cerebral. Es importante destacar que, a diferencia de las tecnologías anteriores, Nuestro enfoque es totalmente compatible con deflectores acústico-ópticos y, por lo tanto, teóricamente capaz de escanear en la escala de tiempo de sub-microsegundos (por ejemplo,> 1 MHz) en la tercera dimensión. Por lo tanto, utilizando patrones de exploración resonantes de Lissajous, prevemos la posibilidad de obtener imágenes volumétricas a velocidades de kHz ”, pronosticaron los científicos.
