Una técnica desarrollada recientemente conocida como microscopía de fluorescencia de lámina de luz ha llevado a muchos descubrimientos biológicos al permitir a los investigadores crear imágenes tridimensionales de tejido. incluso embriones de animales vivos, utilizando etiquetas fluorescentes. Ahora, Los investigadores informan de la capacidad de aumentar la profundidad de la imagen de la microscopía de fluorescencia de hoja de luz con el uso de un fenómeno óptico conocido como absorción de tres fotones.

En la revista The Optical Society (OSA) Letras de óptica , los investigadores informan en detalle cómo se puede utilizar la absorción de tres fotones con microscopía de fluorescencia de lámina de luz para obtener imágenes más profundas en los tejidos. Como demostración, utilizaron la técnica combinada para producir imágenes claras en una bola de células cultivadas, conocido como esferoide, alrededor de 450 micrones de diámetro.

"Esta demostración es muy importante ya que aborda una necesidad insatisfecha de obtener mejores imágenes en profundidad, que podría ayudar a los científicos a obtener mejores datos sobre los procesos biológicos, "dijo el líder del equipo de investigación, Kishan Dholakia de la Universidad de St. Andrews en el Reino Unido "Este enfoque podría ser especialmente útil para estudios de neurociencia y biología del desarrollo y podría encontrar aplicación en la obtención de imágenes de múltiples muestras de forma automatizada para el descubrimiento de fármacos".

La luz necesaria para obtener imágenes de las etiquetas fluorescentes puede ser dañina e incluso mortal para las delicadas muestras biológicas, como el tejido cerebral o los embriones de animales, que se utilizan para estudiar el desarrollo y los procesos de las enfermedades. La microscopía de fluorescencia de hoja de luz permite imágenes de alta resolución con poco daño óptico porque ilumina una muestra con solo una fina hoja de luz; otras partes de la muestra no se exponen innecesariamente a la luz.

"Esperamos que la microscopía de fluorescencia de hoja de luz de tres fotones tenga un gran impacto en la obtención de imágenes del cerebro en roedores como ratones y ratas". donde podría usarse para capturar imágenes de campo muy amplio con resolución subcelular, ", dijo el primer autor del artículo, Adrià Escobet-Montalbán.

Imágenes más profundas

Los investigadores querían comparar la microscopía de fluorescencia de hoja de luz de tres fotones con la absorción de dos fotones utilizada anteriormente. En absorción multifotónica, la etiqueta fluorescente emite luz después de absorberse, o estar emocionado por, dos o tres fotones en lugar del fotón utilizado para producir la fluorescencia tradicional.

La absorción multifotónica reduce la luz desenfocada y minimiza la luz que podría dañar la muestra porque utiliza longitudes de onda más largas. que están menos dispersos por tejido, y confinando la luz de excitación a un volumen pequeño. Cuando se utilizan tres fotones para producir fluorescencia en lugar de dos, estos beneficios se amplifican.

Para demostrar su nueva técnica, los investigadores utilizaron una configuración óptica estándar para microscopía de fluorescencia de hoja de luz con un láser pulsado que se utiliza tradicionalmente para la excitación de dos fotones. Aunque este láser no era el más apropiado para crear una excitación eficiente de tres fotones, era ideal para comparar la excitación de dos fotones y la de tres fotones.

El equipo de investigación obtuvo imágenes de esferoides de células renales embrionarias humanas utilizando excitación de dos y tres fotones. Cerca de la superficie del esferoide, Ambas modalidades de imágenes se realizaron de manera similar. Sin embargo, al otro lado del esferoide, la calidad de la imagen para la microscopía de fluorescencia de hoja de luz de tres fotones conservó el contraste de la imagen, mientras que la calidad de la imagen de dos fotones disminuyó considerablemente.

Optimizando la técnica

Para mejorar aún más la imagen de profundidad y el campo de visión, los investigadores experimentaron cambiando el perfil de intensidad de la luz del láser a un rayo de Bessel, que tiene un núcleo brillante central rodeado de anillos concéntricos, en lugar del tradicional rayo láser sólido de Gauss como el de un puntero láser.

"Los haces de Bessel se pueden utilizar en el modo de hoja de luz de dos fotones, pero pueden producir artefactos potenciales debido a sus anillos concéntricos, ", dijo el coautor Federico Gasparoli." Por primera vez, Mostramos numérica y experimentalmente que estos problemas se eliminan en la microscopía de fluorescencia de hoja de luz de tres fotones y que el haz es aún más profundo, haciendo que este enfoque sea muy atractivo ".

Próximo, los investigadores planean mejorar la técnica mediante el uso de sistemas láser en longitudes de onda más largas que están diseñados específicamente para la absorción de tres fotones. Esto debería permitir la obtención de imágenes a mayor profundidad. En paralelo, los investigadores están trabajando para desarrollar formas de detectar la luz emitida por etiquetas fluorescentes en el interior de las muestras.