En reacciones químicas catalizadas por una enzima, la enzima reduce la cantidad de energía de activación requerida al unirse temporalmente con el sustrato y torcerlo en un estado tenso. El k (catalizador) o "kcat" para la reacción se refiere a la constante independiente de la concentración para la velocidad a la que una enzima particular puede metabolizar un sustrato en una molécula de producto. Para calcular kcat, los científicos primero mezclan varios tubos de ensayo con concentraciones variables de sustrato (conocido como "ensayo enzimático") y los prueban a intervalos de tiempo constantes con un espectrofotómetro de luz para medir las concentraciones crecientes de las moléculas del producto. Esta información se traza luego en un gráfico y se analiza.

Calculando las velocidades iniciales

Trace un gráfico de la concentración del producto en función del tiempo para los datos del primer tubo de ensayo del ensayo enzimático. Nota: el eje horizontal debe ser "tiempo" y el eje vertical debe ser "concentración del producto".

Calcule la línea de regresión lineal para los puntos de datos que trazó en la Sección 1, Paso 1. Mientras Excel y gráficos las calculadoras pueden determinar fácilmente este modelo lineal, puede derivar una estimación de la pendiente de la línea de regresión dividiendo la diferencia en la concentración del producto entre puntos de datos adyacentes por su diferencia en el tiempo.

Registre la pendiente de la recta de regresión lineal Sección 1, Paso 2 como "velocidad de reacción inicial (Vo)". Nota: en el modelo de línea de regresión "[concentración del producto] = m [tiempo] + b," el coeficiente "m" es la pendiente.

Repita los pasos 1, 2 y 3 para el resto de los tubos de prueba en el ensayo.

Cálculo de Vmax

Trace el inverso de la concentración de sustrato para cada tubo de ensayo versus el inverso de su velocidad de reacción inicial (de la Sección 1, Paso 4). Por ejemplo, si la velocidad inicial para un tubo de ensayo con una concentración de sustrato inicial de 50 micromolar (uM) fuera de 80 uM /s, las inversas serían 1/50 uM para la concentración de sustrato y 1/80 uM /s para la inicial velocidad. Nota: la concentración del sustrato inverso debe estar en el eje horizontal, y la velocidad inicial inversa debe estar en el eje vertical.

Nota: la concentración del sustrato debe estar en el eje horizontal, y la velocidad de reacción inicial debe estar en el eje vertical.

Determine la línea de regresión lineal para el gráfico que trazó en la Sección 2, Paso 1. Nota: debido a que necesitará conocer la intersección en y para la línea de regresión, debe ingresar los puntos de la Sección 2, Paso 1 en Excel o en una calculadora gráfica y use la funcionalidad de modelado de regresión incorporada.

Divida 1 por la intersección en y desde la línea de regresión lineal. Esto le dará el valor de la inversa de Vmax, la velocidad de reacción máxima para la enzima. Nota: si el modelo de regresión lineal toma la forma "[Inverse Vo] = m [Inverse Substrate Conc.] + B," entonces el valor de "b" sería el y-intersect. Divida 1 por "b" para calcular el inverso de Vmax.

Divida 1 por el resultado de la Sección 2, Paso 3 para calcular el valor real de Vmax.

Determine la concentración de la enzima en el ensayo original (ver los datos brutos). Nota: la concentración de la enzima es la misma para todos los tubos de ensayo; solo las concentraciones de sustrato varían en el ensayo.

Divida el Vmax (de la Sección 2, Paso 4) por la concentración de la enzima (de la Sección 2, Paso 5). El resultado es el valor de Kcat.