Por Anne Mullenniex Actualizado el 24 de marzo de 2022
Cuantifique su muestra de ARN midiendo su absorbancia de luz ultravioleta (UV). Un espectrofotómetro de nanogota utilizará sólo uno o dos microlitros de su muestra, que podrá recuperar. Otros espectrofotómetros requieren una muestra mucho mayor. El coeficiente de extinción de los nucleótidos a una longitud de onda UV de 260 nm en un camino de luz de 1 cm es 20. Según este coeficiente de extinción, la absorbancia de 40 µg/ml de ARN en las mismas condiciones es uno. Con esta información, puede calcular la concentración de su muestra de ARN.
Haga una dilución, si es necesario, de su muestra. Una dilución estándar para una microcubeta es 1:40. Haga esta dilución agregando 2 µL de muestra de ARN a 78 µL de agua estéril.
Siga los protocolos de su espectrofotómetro particular para calibrar la máquina usando un blanco y luego determine la densidad óptica de su muestra en una longitud de onda UV de 260 nm.
Multiplique la absorbancia de su muestra por su factor de dilución por 40 μg de ARN/mL. La ecuación sería:"Concentración de ARN (μg/ml) =(OD260) x (factor de dilución) x (40μg RNA/ml)/(1 unidad OD260)" (Hofstra.edu) Por ejemplo:si diluyó su muestra en 1:40 y su lectura de absorbancia fue 0,08, multiplicaría 0,08 x 40 x 40 =128 μg/ml =0,13 µg/μL
Calcule la pureza de su muestra tomando otra lectura de absorbancia a una longitud de onda UV de 280 nm. La relación DO 260/OD 280 indicará si su muestra está contaminada con proteína o fenol y en qué nivel. Un resultado de 1,8 a 2,0 indica ARN de calidad.
No olvide calibrar su espectrofotómetro. La aplicación de un gel electroforético rápido confirmará los resultados de sus especificaciones.
No asuma que su muestra es pura. Tomarse el tiempo para una relación OD260/OD280 ahorra tiempo y dinero en el futuro.
