El umbral de concentración de sustrato para el inicio de una reacción enzimática se conoce como constante de Michaelis o Km. Esta es la concentración de sustrato a la que la velocidad de reacción es la mitad de la Vmax. En este punto, la mitad de los sitios activos de la enzima están ocupados con moléculas de sustrato y la reacción avanza a la mitad de su velocidad máxima posible. Aumentar la concentración de sustrato por encima de Km aumentará la velocidad de reacción, pero no alcanzará la Vmax hasta que todos los sitios activos de la enzima estén saturados.
El Km es un parámetro importante para comprender la cinética de reacciones enzimáticas. Se puede utilizar para determinar la afinidad de una enzima por su sustrato y también se puede utilizar para calcular la velocidad de una reacción enzimática a una concentración de sustrato determinada.