Lisis celular:
- El procedimiento de lisis normalmente comienza con la resuspensión de células bacterianas en un tampón que contiene NaOH. Este tampón crea un ambiente alcalino con un pH alto, generalmente entre 12 y 12,8.
- A este pH alto, las membranas y paredes celulares de las bacterias se alteran, lo que provoca la lisis celular. Los componentes celulares, incluido el ADN plasmídico, se liberan en el lisado.
Desnaturalización del ADN cromosómico:
- El entorno de alto pH creado por NaOH ataca y desnaturaliza específicamente el ADN cromosómico de las bacterias. El ADN cromosómico suele ser grande y complejo y consta de una única molécula circular.
- Las fuertes condiciones alcalinas hacen que se rompan los enlaces de hidrógeno entre las cadenas de ADN complementarias, lo que provoca la desnaturalización y fragmentación del ADN cromosómico. Esta desnaturalización altera efectivamente la integridad estructural del ADN cromosómico, haciéndolo no funcional.
Conservación del ADN plásmido:
- A diferencia del ADN cromosómico, el ADN plasmídico es más resistente a la desnaturalización por NaOH. Las moléculas de plásmidos suelen ser pequeñas, circulares y de doble cadena, con una estructura superenrollada que mejora su estabilidad.
- La conformación superenrollada del ADN plasmídico le permite resistir las condiciones alcalinas mejor que el ADN cromosómico. Por tanto, mientras el ADN cromosómico se desnaturaliza, el ADN plasmídico permanece intacto y mantiene su estructura circular covalentemente cerrada.
Neutralización:
- Después del paso de lisis, el lisado que contiene el ADN cromosómico desnaturalizado y el ADN plasmídico intacto se neutraliza utilizando un tampón que contiene un agente neutralizante, como Tris-HCl o tampón acetato.
- La neutralización devuelve el pH del lisado a un rango fisiológico, normalmente alrededor de pH 7-8. Este paso es esencial para detener el proceso de desnaturalización y asegurar la estabilidad del ADN plásmido.
Aislamiento de ADN plásmido:
- Después de la neutralización, el lisado se puede procesar adicionalmente para aislar el ADN plasmídico. Esto puede implicar pasos adicionales como centrifugación, purificación y técnicas de separación basadas en tamaños para separar el ADN plasmídico de otros componentes celulares.
Al desnaturalizar selectivamente el ADN cromosómico y al mismo tiempo preservar la integridad del ADN plasmídico, el NaOH desempeña un papel fundamental en el procedimiento de lisis, lo que permite el aislamiento eficiente de moléculas de plásmido cerradas covalentemente para diversas aplicaciones posteriores, incluida la secuenciación de ADN, la clonación y los experimentos de ingeniería genética.
