Prueba de matriz de papel para identificar especies bacterianas. Para cada prueba, se coloca una muestra bacteriana en los puntos que contienen cada uno de los cuatro tintes fluorescentes que se muestran en el rectángulo. Se pueden realizar hasta 20 pruebas en una tarjeta. Crédito:Química analítica (2022). DOI:10.1021/acs.analchem.1c05021
Las infecciones bacterianas son la principal causa de enfermedad y muerte en todo el mundo; un problema de salud pública en curso exacerbado por diagnósticos lentos o inexactos. Ahora, los científicos financiados por NIBIB han diseñado una prueba económica en papel que puede identificar rápidamente múltiples tipos de bacterias.
El equipo de investigación de la Universidad de Nebraska utilizó una combinación compleja de microbiología, química e inteligencia artificial (IA) para crear una plataforma de prueba que aparentemente parece de baja tecnología, diseñada para su uso en entornos remotos de bajos recursos, como hospitales de campaña y áreas rurales. clínicas
"Hemos diseñado esta tecnología para que sea extremadamente sensible y precisa para identificar especies bacterianas y al mismo tiempo sea fácil de fabricar", explicó Denis Svechkarev, Ph.D., profesor asistente de investigación en el departamento de ciencias farmacéuticas y coautor principal del artículo. con el estudiante graduado Aayushi Laliwala. "La prueba también es lo suficientemente duradera como para sobrevivir al envío a ubicaciones remotas y lo suficientemente simple como para que la utilice fácilmente el personal de atención médica con capacitación y equipo limitados".
El trabajo se lleva a cabo en el laboratorio de Aaron M. Mohs, Ph.D., profesor asociado en el departamento de ciencias farmacéuticas y autor principal de la publicación, que apareció en la revista Analytical Chemistry el 24 de enero.
Gráfico que muestra que las células bacterianas completas generaron distintos patrones fluorescentes. Se crean diferentes patrones fluorescentes debido a las diferentes interacciones de los tintes fluorescentes en cada envoltura bacteriana. Crédito:Química analítica (2022). DOI:10.1021/acs.analchem.1c05021
La plataforma "simple", que se encuentra en las etapas de desarrollo y prueba con la esperanza de un uso eventual en el campo, tiene un nombre complejo, "Conjunto de sensores fluorescentes radiométricos basados en papel". Aproximadamente del tamaño de una tarjeta de 3 x 5, el sensor de papel está "arreglado" con una cuadrícula de pequeños círculos en los que se aplican las muestras bacterianas que se van a analizar. La parte "fluorescente radiométrica" del nombre se refiere a la forma ingeniosa en que se identifican las bacterias.
El equipo de investigación diseñó y sintetizó tintes fluorescentes que pueden "sentir" las sutiles diferencias bioquímicas de cada tipo de bacteria y convertir esas diferencias en diferentes señales fluorescentes. Cuatro tintes fluorescentes diferentes se secan en cuatro círculos en la matriz que comprende una sola prueba. Se coloca una muestra bacteriana, como e. coli, en cada uno de los cuatro círculos y los tintes se activan con luz ultravioleta, lo que da como resultado que los cuatro tintes emitan cinco señales fluorescentes para un total de 20 señales fluorescentes por prueba.
Un lector de placas fluorescentes escanea las 20 señales fluorescentes, que varían según la interacción de los colorantes con la membrana externa de la bacteria. Se entrenó un programa de IA de última generación, en forma de red neuronal artificial, para reconocer el patrón sutil pero específico de intensidades fluorescentes creadas por cada tipo de bacteria. El resultado es un patrón fluorescente de "firma" que se transfiere del lector al programa de red neuronal artificial, que identifica el tipo de bacteria.
En colaboración con los microbiólogos, los Dres. Marat R. Sadykov y Kenneth W. Bayles, el equipo probó el sistema utilizando una colección de 16 especies bacterianas. El sistema identificó correctamente las 16 especies más del 90 % de las veces, un nivel de precisión que podría proporcionar a un trabajador de la salud en el campo información valiosa sobre las bacterias específicas en un individuo infectado, lo que permite un tratamiento antibiótico preciso y rápido. La prueba también determinó si la bacteria era gram positiva o negativa con un 95 % de precisión. La prueba de Gram es una técnica que determina aún más la composición de las bacterias y es fundamental para saber qué tipos de antibióticos son más efectivos. La precisión de la prueba fue extremadamente prometedora si se tiene en cuenta que unas pocas horas de retraso en el diagnóstico y tratamiento de una enfermedad infecciosa empeora drásticamente el pronóstico del paciente.
Colores generados por la bacteria Staphylococcus aureus teñidos con tres colorantes fluorescentes diferentes. La parte superior izquierda es S. aureus sin tinción fluorescente. Crédito:Química analítica (2022). DOI:10.1021/acs.analchem.1c05021
Cada aspecto de la prueba fue diseñado para su uso potencial incluso en las partes más remotas del mundo, donde las técnicas actuales que requieren equipo sofisticado y experiencia no son viables. Por ejemplo, secar los tintes fluorescentes en la tarjeta de papel eliminó la necesidad de usar tintes fluorescentes líquidos que requerirían refrigeración, que a menudo no está disponible en regiones de bajos recursos. La fotolitografía se utilizó para "fotoestampar" la cuadrícula de círculos en la tarjeta de papel, una forma rápida y económica de fabricar miles de tarjetas. En las pruebas, realizadas colocando las tarjetas en una caja en el armario, las tarjetas se mantuvieron estables hasta por seis meses, lo que las hace ideales para el envío y la distribución a áreas remotas. El patrón de la tarjeta es idéntico al de las placas de 96 pocillos utilizadas para muchas pruebas que utilizan componentes líquidos, lo que permite escanear y leer las tarjetas de papel mediante máquinas estándar fácilmente disponibles.
"Este proyecto es un ejemplo extraordinario de cómo hacer algo simple requiere el uso de múltiples tecnologías complejas", dijo Tatjana Atanasijevic, Ph.D., (Gerente del Programa Científico) del programa de Sensores Bioanalíticos del Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería. (NIBIB), que cofinanció el proyecto junto con varios institutos adicionales en los Institutos Nacionales de Salud.
El trabajo se encuentra en la etapa de investigación y desarrollo y el equipo está probando y refinando el sistema utilizando muestras que replican lo que se recolectaría de los pacientes en el campo. Future technical feats in the team's crosshairs include working with engineers to create a system that would allow the paper 96-spot card to be read with a simpler device, maybe even a cell phone camera—an admittedly lofty goal, but doable explained Svechkarev.
Asked about the work, Mohs credits the extraordinary effort of Svechkarev and Laliwala. "The technology needed to create this bacterial detection system was devised during the pandemic when we had limited access to the laboratory. Denis and Aayushi used this time to develop skills that included new computer coding methods, learning how to use different types of artificial intelligence, and finalizing the design of the best fluorescent dyes—all key elements that came together to build this promising diagnostic system." Visualizing the internal compartments of living plant cells using fluorescent naphthalimide dyes
