(a) El tinte fluorescente doblemente marcado en el cuerpo Q basado en fragmentos de antígeno se apaga al unirse con el antígeno objetivo, mostrando así señalización fluorescente para visualizar el objetivo intracelular. (b) variación dependiente de la concentración del péptido p53 en la intensidad de la señal de fluorescencia. (c) Q-body muestra una señal fluorescente alta al unirse con el objetivo en células que expresan p53, en comparación con las células humanas negativas para 'p53'. ( d ) Imágenes de microscopía confocal de HCT116 p53 y SK-BR-3. Las células que no expresan p53, es decir, HCT116 p53(-/-) no muestran fluorescencia basada en TAMRA, mientras que otras (incluidas las imágenes teñidas con colorante Hoechst para iluminar el núcleo y bajo campo claro para mostrar las células) muestran una fluorescencia significativa. Crédito:Tecnología de Tokio
Los avances recientes en la tecnología de imágenes han hecho posible visualizar la dinámica intracelular, lo que ofrece una mejor comprensión de varios principios biológicos clave para acelerar el desarrollo terapéutico. El marcaje fluorescente es una de esas técnicas que se utiliza para identificar proteínas intracelulares, su dinámica y disfunción. Tanto las sondas internas como las externas con tintes fluorescentes se utilizan para este propósito, aunque las sondas externas pueden visualizar mejor las proteínas intracelulares en comparación con las sondas internas. Sin embargo, su aplicación está limitada por la unión no específica a los componentes intracelulares, lo que da como resultado una señalización específica del objetivo baja y un ruido de fondo más alto.
Recientemente, un inmunosensor marcado con colorante fluorescente conocido como Quenchbody (cuerpo Q) se ha utilizado con éxito para detectar antígenos en soluciones o en la superficie celular. Un cuerpo Q es esencialmente un fragmento de anticuerpo con la capacidad de unirse a un antígeno específico.
En este contexto, investigadores de Japón y Singapur, dirigidos por el Prof. Hiroshi Ueda del Instituto de Tecnología de Tokio (Tokyo Tech), Japón, informaron recientemente sobre la aplicabilidad de los cuerpos Q para obtener imágenes de proteínas intracelulares en células vivas. Sus hallazgos ahora se publican en Chemical Science .
"Dado que Q-body funciona como una herramienta de imagen específica del sitio y dependiente del antígeno, planteamos la hipótesis de que mostrará una fluorescencia conmutable dependiente del antígeno al interactuar con la proteína objetivo, lo que permite una visualización precisa de la dinámica intracelular. Lo demostramos sintetizando un Q-body para p53, una proteína biomarcadora supresora de tumores que desempeña un papel importante en la reparación del ADN, la división celular y la muerte celular", explica el Prof. Ueda.
El equipo sintetizó un cuerpo Q marcado con tinte de fluorescencia "doble" llamado "cuerpo Q C11_Fab", que mostró una mejor sensibilidad y especificidad de objetivo en comparación con las sondas convencionales en células cancerosas humanas que expresan p53. Dado que la expresión de p53 aumenta en las células cancerosas, electroporaron el cuerpo Q en varias líneas de células cancerosas humanas para validar su hipótesis.
En comparación con una sonda tradicional que mostraba señales de fluorescencia continua incluso en ausencia de p53, la sonda de cuerpo Q mostraba señales de fluorescencia en células "fijadas" (células con proteínas desnaturalizadas para detener la descomposición) que expresaban p53. Además, la sonda Q-body podía visualizar p53 de tipo salvaje (control) y mutante en muestras de células fijadas.
Además, el equipo observó señales de fluorescencia con una intensidad 8 veces mayor en líneas celulares de cáncer de colon humano vivo con expresión de p53 en comparación con las negativas. Curiosamente, el cuerpo Q se mantuvo estable a largo plazo y mostró cambios en la intensidad de la fluorescencia con cambios inducidos experimentalmente en los niveles de p53.
La citometría de flujo reveló una mayor inmunofluorescencia con cuerpo Q en células que expresan p53. Además, en la clasificación, la proporción y la señal de fluorescencia de estas células fue significativamente mayor en comparación con las demás (con o sin cuerpo Q).
El profesor Ueda dice:"Las técnicas existentes no pueden proporcionar imágenes precisas de objetivos intracelulares menos abundantes con alta especificidad y sensibilidad. En este contexto, nuestro estudio demuestra el potencial de los cuerpos Q en imágenes de células vivas para una mejor visualización de los cambios intracelulares dinámicos. , y proporciona un enfoque para la clasificación específica de antígenos intracelulares de células vivas utilizando un cuerpo Q".
De cara al futuro, podemos esperar el desarrollo de muchos más cuerpos Q para visualizar otros biomarcadores intracelulares, lo que abre las puertas a un mejor desarrollo terapéutico basado en células y a la investigación del cáncer. Arrojando nueva luz:Un nuevo tipo de inmunosensor para pruebas de inmunoensayo
