Las reacciones involucradas en el ensayo FIND-IT para detectar la infección por el virus SARS-CoV-2. Cuando la enzima Cas13 (abajo a la izquierda) se une a su ARN objetivo, corta una molécula (cinta naranja y azul claro) para liberar un activador (naranja) que sobrecarga la nucleasa Csm6 (derecha) para escindir y liberar moléculas fluorescentes que se iluminan (verde) y señalan la presencia de ARN viral. Crédito:Margaret L. Liu, Facultad de Medicina Pritzker de la Universidad de Chicago.
Frecuente, Las pruebas rápidas de COVID-19 son fundamentales para controlar la propagación de los brotes. especialmente como nuevo, surgen variantes más transmisibles.
Si bien la prueba de diagnóstico COVID-19 estándar de oro de hoy, que utiliza qRT-PCR, reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (PCR), es extremadamente sensible, detectar hasta una copia de ARN por microlitro, requiere equipo especializado, un tiempo de ejecución de varias horas y una instalación de laboratorio centralizada. Como resultado, las pruebas suelen tardar al menos uno o dos días.
Un equipo de investigación dirigido por científicos en los laboratorios de Jennifer Doudna, David Savage y Patrick Hsu en la Universidad de California, Berkeley, tiene como objetivo desarrollar una prueba de diagnóstico que sea mucho más rápida y fácil de implementar que la qRT-PCR. Ahora ha combinado dos tipos diferentes de enzimas CRISPR para crear un ensayo que puede detectar pequeñas cantidades de ARN viral en menos de una hora. Doudna compartió el Premio Nobel de Química 2020 por la invención de la edición del genoma CRISPR-Cas9.
Si bien la nueva técnica aún no se encuentra en la etapa en la que compite con la sensibilidad de qRT-PCR, que puede detectar solo unas pocas copias del virus por microlitro de líquido, ya es capaz de captar niveles de ARN viral, unas 30 copias por microlitro, suficientes para vigilar a la población y limitar la propagación de infecciones.
"No se necesita la sensibilidad de la PCR para detectar y diagnosticar básicamente COVID-19 en la comunidad, si la prueba es lo suficientemente conveniente y rápida, "dijo el coautor David Savage, profesor de biología molecular y celular. "Nuestra esperanza era llevar la bioquímica lo más lejos posible hasta el punto en que se pudiera imaginar un formato muy conveniente en un entorno en el que se pueda realizar la prueba todos los días, decir, a la entrada del trabajo ".
Los investigadores informarán sus resultados en línea el 5 de agosto en la revista. Biología química de la naturaleza .
Varios ensayos basados en CRISPR han sido autorizados para uso de emergencia por la Administración de Alimentos y Medicamentos, pero todos requieren un paso inicial en el que se amplifica el ARN viral para que la señal de detección, que implica la liberación de una molécula fluorescente que brilla bajo luz azul, sea lo suficientemente brillante como para verla. Si bien esta amplificación inicial aumenta la sensibilidad de la prueba a un nivel similar al de qRT-PCR, también presenta pasos que hacen que la prueba sea más difícil de realizar fuera de un laboratorio.
El equipo dirigido por UC Berkeley buscó alcanzar una sensibilidad y velocidad útiles sin sacrificar la simplicidad del ensayo.
"Para aplicaciones en el punto de atención, desea tener una respuesta rápida para que las personas puedan saber rápidamente si están infectadas o no, antes de tomar un vuelo, por ejemplo, o ir a visitar a familiares, "dijo la líder del equipo Tina Liu, un científico investigador en el laboratorio de Doudna en el Innovative Genomics Institute (IGI), un centro centrado en CRISPR que involucra a científicos de UC Berkeley y UC San Francisco.
Aparte de tener un paso adicional, otra desventaja de la amplificación inicial es que, porque produce miles de millones de copias de ARN viral, Existe una mayor probabilidad de contaminación cruzada en las muestras de pacientes. La nueva técnica desarrollada por el equipo le da la vuelta a esto y en su lugar aumenta la señal fluorescente, eliminando una fuente importante de contaminación cruzada.
La técnica sin amplificación, que ellos denominan Detección Rápida Integrada de Nucleasas en Tándem (FIND-IT), podría permitir pruebas de diagnóstico rápidas y económicas para muchas otras enfermedades infecciosas.
"Si bien comenzamos este proyecto con el propósito expreso de impactar COVID-19, Creo que esta técnica en particular podría aplicarse a algo más que a esta pandemia porque, por último, CRISPR es programable, "Dijo Liu." Entonces, podría cargar la enzima CRISPR con una secuencia dirigida al virus de la gripe o al virus del VIH o cualquier tipo de virus de ARN, y el sistema tiene el potencial de funcionar de la misma manera. Este documento realmente establece que esta bioquímica es una forma más sencilla de detectar ARN y tiene la capacidad de detectar ese ARN en un marco de tiempo sensible y rápido que podría ser susceptible de aplicaciones futuras en el diagnóstico en el punto de atención ".
Los investigadores están actualmente en el proceso de construir un diagnóstico de este tipo utilizando FIND-IT, que incluiría pasos para recolectar y procesar muestras y ejecutar el ensayo en un dispositivo microfluídico compacto.
Empleando proteínas Cas en tándem
Para eliminar la amplificación del objetivo de la ecuación, el equipo empleó una enzima CRISPR, Cas13, para detectar primero el ARN viral, y otro tipo de proteína Cas, llamado Csm6, para amplificar la señal de fluorescencia.
Cas13 es una tijera de uso general para cortar ARN; una vez que se une a su secuencia objetivo, especificado por un ARN guía, está preparado para cortar una amplia gama de otras moléculas de ARN. Esta actividad de corte activada por la diana se puede aprovechar para acoplar la detección de una secuencia de ARN específica a la liberación de una molécula indicadora fluorescente. Sin embargo, por sí mismo, Cas13 puede requerir horas para generar una señal detectable cuando están presentes cantidades muy bajas de ARN objetivo.
La idea de Liu fue utilizar Csm6 para amplificar el efecto de Cas13. Csm6 es una enzima CRISPR que detecta la presencia de pequeños anillos de ARN y se activa para cortar una amplia gama de moléculas de ARN en las células.
Para aumentar la detección de Cas13, ella y sus colegas diseñaron una molécula activadora especialmente diseñada que se corta cuando Cas13 detecta ARN viral. Un fragmento de esta molécula puede unirse y provocar que Csm6 corte y libere una molécula fluorescente brillante a partir de un fragmento de ARN. Normalmente, la molécula activadora es rápidamente degradada por Csm6, limitando así la cantidad de señal fluorescente que puede generar. Liu y sus colegas idearon una forma de modificar químicamente el activador para que esté protegido de la degradación y pueda sobrecargar Csm6 para cortar y liberar repetidamente moléculas fluorescentes unidas al ARN. Esto da como resultado una sensibilidad 100 veces mejor que la del activador original.
"Cuando se activa Cas13, escinde este pequeño activador, quitar un segmento que lo protege, "Dijo Liu." Ahora que está liberado, puede activar muchas moléculas diferentes de esa segunda enzima, Csm6. Y entonces, un objetivo reconocido por Cas13 no solo conduce a la activación de su propia capacidad de corte de ARN; conduce a la generación de muchas más enzimas activas que pueden escindir cada una de ellas incluso más indicadores fluorescentes ".
El equipo de investigadores también incorporó una combinación optimizada de ARN guía que permite un reconocimiento más sensible del ARN viral por parte de Cas13. Cuando esto se combinó con Csm6 y su activador, el equipo pudo detectar hasta 31 copias por microlitro de ARN del SARS-CoV-2 en tan solo 20 minutos.
Los investigadores también agregaron ARN extraído de muestras de pacientes al ensayo FIND-IT en un cartucho de microfluidos. para ver si este ensayo podría adaptarse para ejecutarse en un dispositivo portátil. Usando un dispositivo pequeño con una cámara, pudieron detectar el ARN del SARS-CoV-2 extraído de muestras de pacientes con una sensibilidad que capturaría las infecciones por COVID-19 en su punto máximo.
"Este enfoque de nucleasa en tándem, Cas13 más Csm6, combina todo en una sola reacción a una sola temperatura, 37 grados centígrados, por lo que no requiere calentamiento a alta temperatura o múltiples pasos, como es necesario para otras técnicas de diagnóstico, ", Dijo Liu." Creo que esto abre oportunidades para más rápido, pruebas más simples que pueden alcanzar una sensibilidad comparable a otras técnicas actuales y que potencialmente podrían alcanzar sensibilidades aún mayores en el futuro ".
El desarrollo de este método sin amplificación para la detección de ARN resultó de una reorientación de la investigación dentro de IGI cuando la pandemia comenzó hacia problemas de diagnóstico y tratamiento de COVID-19. Por último, cinco laboratorios en UC Berkeley y dos laboratorios en UCSF se involucraron en este proyecto de investigación, uno de muchos dentro del IGI.
"Cuando comenzamos esto, teníamos la esperanza de crear algo que alcanzara la paridad con PCR, pero no requirió amplificación, ese sería el sueño, "dijo Savage, quien fue el investigador principal del proyecto. "Y desde una perspectiva de sensibilidad, teníamos una brecha diez mil veces mayor que saltar. Lo hemos multiplicado por mil; lo hemos reducido en unos tres órdenes de magnitud. Entonces, casi estámos allí. Pasado abril, cuando realmente estábamos empezando a trazarlo, eso parecía casi imposible ".