La cantidad de proteínas en el cuerpo humano, colectivamente conocido como el proteoma, es vasto. En algún lugar entre 80, 000 y 400, 000 proteínas circulan en nuestras células, tejidos y órganos, llevando a cabo una amplia gama de funciones esenciales para la vida. Cuando las proteínas salen mal, son responsables de una gran cantidad de enfermedades graves.

Ahora, investigadores del Biodesign Center for Applied Structural Discovery y la Escuela de Ciencias Moleculares de ASU, junto con sus compañeros, investigar una clase de proteínas de importancia crítica, que adornan las membranas externas de las células. Estas proteínas de membrana a menudo actúan como receptores para unir moléculas, iniciar señales que pueden alterar el comportamiento celular de diversas formas.

En el nuevo estudio se describe un nuevo enfoque para adquirir datos estructurales de proteínas de membrana con asombroso detalle. Métodos de microscopía electrónica criogénica (o crio-EM), un innovador conjunto de herramientas, se utiliza. Más lejos, El uso de la denominada cristalización LCP y la difracción de electrones de microcristales (MicroED) ayuda a revelar detalles estructurales de proteínas que han sido en gran parte inaccesibles a través de enfoques convencionales como la cristalografía de rayos X.

Los hallazgos describen el primer uso de microcristales embebidos en LCP para revelar detalles estructurales de proteínas de alta resolución utilizando MicroED. La nueva investigación adorna la portada del número actual de la revista Cell Press. Estructura .

"LCP fue un gran éxito en la cristalización de proteínas de membrana, según Wei Liu, un autor correspondiente del nuevo estudio. "La nueva aplicación extensa de LCP-MicroED ofrece la promesa de enfoques mejorados para la determinación estructural de objetivos de proteínas desafiantes. Estos planos estructurales se pueden utilizar para facilitar el diseño de nuevos fármacos terapéuticos a partir de conocimientos más precisos".

Una clase de proteínas de membrana de particular interés son los receptores acoplados a proteínas G (GPCR), que forman el grupo más grande y variado de receptores de membrana que se encuentran en los organismos eucariotas, incluidos los humanos.

Las actividades fisiológicas de los GPCR son tan importantes que son un objetivo importante para una amplia gama de fármacos terapéuticos. Aquí es donde surgen los problemas, sin embargo, ya que determinar la estructura detallada de las proteínas de la membrana, un precursor esencial para el diseño preciso de un fármaco, a menudo plantea enormes desafíos.

La técnica de cristalografía de rayos X se ha utilizado para investigar las estructuras a escala atómica e incluso el comportamiento dinámico de muchas proteínas. Aquí, Las muestras cristalizadas de la proteína en estudio se golpean con un haz de rayos X, causando patrones de difracción, que aparecen en una pantalla. El ensamblaje de miles de instantáneas de difracción permite ensamblar una imagen estructural 3-D de alta resolución con la ayuda de computadoras.

Sin embargo, muchas proteínas de membrana, incluidos los GPCR, no forme grandes, Cristales bien ordenados apropiados para cristalografía de rayos X. Más lejos, estas proteínas son delicadas y se dañan fácilmente con la radiación X. Solucionar el problema ha requerido el uso de dispositivos especiales conocidos como láseres de electrones libres de rayos X o XFELS, que puede ofrecer una brillante ráfaga de luz de rayos X que dura solo femtosegundos, (un femtosegundo es igual a una cuadrillonésima parte de un segundo o aproximadamente el tiempo que tarda un rayo de luz en atravesar el diámetro de un virus). La técnica de cristalografía de rayos X de femtosegundos en serie permite a los investigadores obtener una imagen de refracción antes de que se destruya la muestra cristalizada.

Sin embargo, La cristalización de muchas proteínas de membrana sigue siendo un arte extremadamente difícil e impreciso y solo un puñado de estas gigantescas máquinas XFEL existen en el mundo.

Ingrese microscopía electrónica criogénica y MicroED. Esta técnica innovadora implica la congelación instantánea de cristales de proteína en una fina capa de hielo, luego sometiéndolos a un haz de electrones. Como en el caso de la cristalografía de rayos X, el método utiliza patrones de difracción, esta vez de electrones en lugar de rayos X, para ensamblar estructuras finales detalladas.

MicroED se destaca en la recopilación de datos de cristales demasiado pequeños e irregulares para ser utilizados en cristalografía de rayos X convencional. En el nuevo estudio, Los investigadores utilizaron dos técnicas avanzadas en tándem para producir imágenes de difracción de alta resolución de dos proteínas modelo importantes:la proteinasa K y el receptor de adenosina A2A. cuyas funciones incluyen la modulación de neurotransmisores en el cerebro, vasodilatación cardíaca y respuesta inmune de las células T.

Las proteínas estaban incrustadas en un tipo especial de cristal conocido como fase cúbica lipídica o cristal LCP. que imita el entorno nativo en el que se encuentran tales proteínas de forma natural. Las muestras de LCP se sometieron luego a microscopía electrónica, utilizando el método MicroED, que permite la formación de imágenes de extremadamente delgadas, cristales de tamaño submicrónico. Más lejos, La rotación continua de los cristales de LCP bajo el microscopio electrónico permite adquirir múltiples patrones de difracción de un solo cristal con un valor extremadamente bajo, Dosis de electrones sin daños.

La capacidad de examinar proteínas que solo pueden formar microcristales o nanocristales abre la puerta a la determinación estructural de muchas proteínas de membrana de vital importancia que han eludido los medios convencionales de investigación. particularmente GPCR.