Estructura del SUP aniónico, dispositivos para mediciones de conductividad de protones y rendimiento de diferentes SUP en estos dispositivos. (A) Estructura primaria de SUP diseñados con varias densidades de carga. (B) Protocolo de fabricación de películas de proteínas depositadas en IDE de oro. (C) Medición de impedancia de la muestra E72 en forma de gráfico de Nyquist bajo diferentes HR. La figura (ii) es la región de ampliación de (i) indicada por el cuadrado azul. (D) Gráfico de Nyquist de películas delgadas de proteína de las muestras E72, HC_E35, y DC_E108 equilibrado a RH =90%. La intersección extrapolada del semicírculo observado con el eje x es indicativa de la resistencia de la muestra que escala como HC_E35> E72> DC_E108. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.abc0810
Los protones son partículas subatómicas con carga eléctrica positiva. La translocación de protones juega un papel importante en los fenómenos naturales y las tecnologías artificiales. Pero sigue siendo un desafío controlar la conducción y fabricación de protones en biomateriales y dispositivos. En un nuevo informe, Chao Ma y un equipo interdisciplinario de científicos en China, Los países bajos, y Alemania, Materiales constituyentes de proteínas conductoras de protones diseñados racionalmente que excedían los sistemas proteicos (que consisten en proteínas o que las contienen) informadas anteriormente. Desarrollaron las estructuras a través de la exploración paso a paso de secuencias de péptidos, desde espirales intrínsecamente desordenadas hasta quimeras de polipéptidos sobrecargados de proteínas. El nuevo paradigma de diseño ofrece potencial para la fabricación de dispositivos bioprotónicos en las interfaces de sistemas artificiales y biológicos, los resultados se publican en Avances de la ciencia .
La conducción de protones es responsable de procesos fundamentales en biología, incluyendo bioluminiscencia, la síntesis de adenosina 5'-trifosfato (ATP) y la translocación de protones activada por la luz. Los bioingenieros y científicos de materiales habían desarrollado previamente varios materiales sintéticos con comportamiento de translocación de protones, incluidos sistemas híbridos, aunque sus deficiencias han obstaculizado los campos de la bioelectrónica y la biotecnología. Desarrollar biomateriales dedicados a la conducción de protones, los científicos deben explorar los andamios y las secuencias de su comportamiento intrínseco de conducción de protones. Durante estados hidratados, Los protones se pueden transportar a través de moléculas de agua a lo largo de una red de enlaces adyacentes en un mecanismo conocido como salto de protones. que se utiliza como modelo para diseñar estructuras conductoras de protones de novo (es decir, desde cero). En este trabajo, Ma et al. desarrollado un paso a paso, Membrana conductora de protones a base de proteínas con un conjunto de polipéptidos aniónicos sobrealimentados (SUP) que contienen residuos de ácido glutámico.
Películas de proteínas sobre sustratos y caracterización mediante SEM y AFM. (A) Procedimiento esquemático para la preparación de películas de polipéptidos y proteínas conductores de protones mediante la técnica de fundición por gotas utilizada en este estudio. (B) Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) que muestran la morfología plana y homogénea de nuestra película delgada personalizada (aquí se muestra E72 como ejemplo) en los electrodos. El borde dentado en el lado izquierdo de a) es la posición de truncado para la formación de imágenes de sección transversal en b). (C) Imagen AFM de una superficie de película delgada rayada (arriba) y su perfil de altura correspondiente (abajo). La muestra E72 se muestra aquí como ejemplo. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.abc0810 
En la estructura polipeptídica de la membrana conductora de protones, los restos cargados hidrófilos (amantes del agua) sirvieron como portadores de protones. El equipo estudió el rendimiento de conducción de protones de estos sistemas desplegados para obtener membranas independientes y perfeccionó el diseño estructural mediante la fusión de estructuras de láminas β parecidas a la seda con SUP aniónicos para formar nanoestructuras autoensambladas. El equipo decoró las superficies con densos grupos de ácido carboxílico para la hidratación, disociación de protones y para formar vías de conducción de protones. La membrana autoestable y mecánicamente estable superó las propiedades de transporte hasta ahora reportadas de los sistemas basados en proteínas para una conductividad de protones sobresaliente.
El equipo derivó las proteínas sobrealimentadas de la elastina; explorado previamente para aplicaciones de ingeniería de proteínas y modificación de interfaces. Introdujeron ácido glutámico (abreviado Glu o E), que puede desprotonarse fácilmente en condiciones fisiológicas en el sitio X de la secuencia de la proteína, para formar polipéptidos supercargados negativamente no estructurados (SUP-Es). Luego construyeron tres variantes diferentes de polipéptidos sobrealimentados conocidos como E72, HC_E35 y DC_E108. Ma et al. utilizaron espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS) con electrodos interdigitados de oro (IDE) para evaluar la conducción de protones de película delgada y el transporte de protones medido en función de la humedad relativa. Cuando la humedad aumentó al 90 por ciento, la translocación de protones mejoró debido a la absorción de un gran número de moléculas de agua a través de los grupos de ácido carboxílico (-COOH) del material. Además de la humedad relativa, también investigaron la conducción de protones en relación con la densidad del portador de carga para las muestras de interés. Al ajustar la densidad de carga de las proteínas desordenadas, Ma et al. controló con éxito el comportamiento de la conductancia de protones de las proteínas dentro de las películas. Debido a la alta estabilidad y uniformidad de las películas delgadas hechas de SUP, la configuración no mostró signos de defectos.
-30GFP sobrealimentado compuesto por un pliegue de barril β nanoscópico para la conducción de protones. (A) Estructura 3D de -30GFP sobrealimentado con exceso de ácidos glutámico / aspártico (en rojo) en la superficie de la proteína. La caricatura de la izquierda visualiza la estructura en modo de superficie, mostrando residuos positivos en azul y negativos en rojo. La caricatura de la derecha visualiza el −30GFP como un diagrama de cinta que presenta exclusivamente cargas negativas. (B) Medición de impedancia de la muestra -30GFP (puntos sólidos amarillentos) en el trazado de Nyquist al 90% de HR, en comparación con otras muestras de SUP. (C) Comparación de conductancia entre muestras E72, HC_E35, DC_E108, y −30GFP (** P =0,004, n> 3). (D) Patrones GIXD para la investigación de estructuras de las diferentes películas. Se observaron dos señales distintas para el -30GFP nanoestructurado (izquierda), mientras que no se detectó señal para las películas E72 (derecha), indicando su naturaleza desestructurada. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.abc0810 
Ma et al. luego estudió más a fondo las cadenas principales de proteínas de tamaño nanométrico plegadas y equipó los andamios a nanoescala con ácido carboxílico en la superficie, similar a los SUP. Usando difracción de rayos X, Investigaron información estructural dentro de las muestras de proteínas sobrealimentadas para obtener firmas distintas de sus dominios estructurales, para mostrar cómo los componentes nanoestructurados podrían facilitar la translocación de protones. El trabajo permitió al equipo diseñar de manera racional motivos de proteínas para realizar la conducción de protones. Motivado por una mayor conductividad de protones, Ma et al. combinó los elementos de diseño resultantes con las estructuras de polipéptidos supercargados (SUP) existentes.
En lugar de utilizar motivos de barril β en la arquitectura de materiales, utilizaron estructuras de láminas β mecánicamente estables, una secuencia obtenida de la seda de araña. Llamaron al sistema combinado de SUP aniónico con secuencias de hojas β como 'araña-E'. The scientists produced the recombinant anionic spider-E material using plasmid-vector expression systems in the lab and determined the structure using X-ray diffraction, Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy and atomic force microscopy. The spider-E film showed higher proton conductance compared to amorphous SUP films alone.
Sequence, estructura, and proton conduction of recombinant supercharged spider-E thin films on IDE. (A) Rationally designed supercharged spider silk–inspired proteins (spider-E). The spider motif contains a poly-A sequence (green) and anionic supercharged regions (red) that are forming the loops between the rigid β sheets. (B) Structure analyses of the spider-E supported film. Two peaks were detected by GIXD, indicating the characteristic intersheet and interstrand distances, respectivamente. (C) FTIR characterization of the films indicate random coils for the E72 sample (gray dashed line) with an amide I peak located at 1640 cm−1 and a shift to a typical β sheet amide I peak for the spider-E sample (red solid line) at 1620 cm−1. (D) Morphology analyses of the spider-E supported film. Quantification of the nanostructures assembled through spider β sheet domains by AFM. This sample was obtained by extensive swelling of the film by water contact to induce separation between the domains. (E) Nyquist plots obtained at RH =90% for the five genetically engineered samples including spider-E. The impedance curve of the spider-E sample shows the lower resistance value among all the samples (red). (F) Comparison of conductance of the resulting devices demonstrating the stepwise increase in the transport properties due to the improved protein design. The proton transport of spider-E thin films on IDEs is noticeably higher than HC_E35 (***P =0.0009, n> 3) and DC_E108 (*P =0.0155, n> 3). Crédito:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.abc0810 
The β-sheet structured material system showed improved mechanical properties as a free-standing membrane that could be easily produced. Por ejemplo, Ma et al. drop casted the spider-E solution to engineer a transparent macroscopic membrane in the lab. The results showed mechanical robustness of the construct due to the inclusion of spider motifs with a yield strength comparable to recombinant spider silk materials. The researchers showed how spider motifs formed β-sheet structured domains with hydrophilic surfaces composed of glutamic acid-rich SUP strands, to facilitate excellent proton hopping. The study pushed the limits of existing proteinaceous proton-conducting materials to represent a key example of protein engineering. The work represents one of the first examples that combines protein engineering and the rational design of bulk architecture with collective properties from molecular ensembles.
Bulk freestanding chimeric spider-E membrane with extraordinary proton transfer properties. (A) A digital photograph illustrates the dimensions and transparency of the membrane. The protein membrane is clamped with a fine tweezer. Photo credit:Chao Ma, University of Groningen. (B) Mechanical characterization of the freestanding (FS) protein membrane, showing a typical tensile stretching curve. (C) Nyquist plot illustrating the conductance behavior of the FS spider-E membrane under different RHs. The film shows best proton translocation properties at 90% RH. (D) AFM characterization of the FS spider-E membrane under ~30 and ~90% RH conditions. Barras de escala, 100 nm. Blue arrows point at distinguishable nanostructures. (E) Proposed mechanism of proton transport in the spider-E membrane at RH =90%. The protons hop between water molecules nanoconfined in the hydrated network of nanodomains formed by spider β sheet motifs (in green). The glutamic acid residues in the chimeric nanostructures present carboxylic groups (in red) on the surface, providing the protons and coordinating water molecules. Crédito:Science Advances, doi:10.1126/sciadv.abc0810
De este modo, Chao Ma and colleagues applied rational molecular de novo design and engineering to achieve a bioinspired protein-derived bulk material with robust properties of proton conduction and excellent mechanical stability. They tested the surface modifications using a range of biophysical tools. The team developed the new generation, bioinspired bulk material and explored successive sequence designs to offer a promising platform for applications in biotechnology and envision the use of such materials for proton transport in miniaturized biofuel cells of the future.
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