Uno de los principales desafíos de la producción de biocombustibles de segunda generación es identificar enzimas producidas por microorganismos para su uso en un cóctel de enzimas para catalizar la hidrólisis de biomasa en la que las enzimas actúan juntas para descomponer los carbohidratos en la basura de la caña de azúcar y el bagazo. por ejemplo, y convertirlos en azúcares simples para fermentación.

Un grupo de investigadores de la Universidad de Campinas (UNICAMP), trabajando en asociación con colegas del Laboratorio Nacional Brasileño de Biorenovables (LNBR) en Campinas, Estado de São Paulo, Brasil, he descubierto que Trichoderma harzianum , un hongo encontrado en el Amazonas, produce una enzima con el potencial de desempeñar un papel clave en los cócteles de enzimas.

La enzima que se llama β-glucosidasa y pertenece a la familia de glucósido hidrolasa 1 (GH1), actúa en la última etapa de degradación de la biomasa para producir glucosa libre para fermentación y conversión en etanol. En el laboratorio, sin embargo, los investigadores observaron que los altos niveles de glucosa inhibían la actividad de la β-glucosidasa.

"También encontramos que la actividad catalítica óptima de la enzima se produjo a 40 ° C. Esto representó otro obstáculo para el uso de la enzima porque en un entorno industrial, la hidrólisis enzimática de la biomasa se realiza a temperaturas más altas, típicamente alrededor de 50 ° C, "dijo Clelton Aparecido dos Santos, investigador postdoctoral en el Centro de Biología Molecular e Ingeniería Genética de la UNICAMP (CBMEG) con una beca de la FAPESP.

Basado en un análisis de la estructura de la enzima combinado con técnicas de genómica y biología molecular, los investigadores pudieron modificar la estructura para resolver estos problemas y mejorar considerablemente su eficiencia de degradación de biomasa.

El estudio fue el resultado de un proyecto con una beca de investigación regular de la FAPESP y un Proyecto Temático también apoyado por la FAPESP. Los hallazgos se publican en la revista Informes científicos .

"La proteína modificada que desarrollamos demostró ser mucho más eficiente que la enzima no modificada y se puede utilizar para complementar los cócteles de enzimas que se venden hoy en día para descomponer la biomasa y producir biocombustibles de segunda generación". Santos dijo.

Para llegar a la proteína modificada, Inicialmente, los investigadores compararon la estructura cristalina de la molécula original con estructuras de otras β-glucosidasas de tipo salvaje en las familias de glucósidos hidrolasas GH1 y GH3. Los resultados del análisis mostraron que las glucosidasas GH1 tolerantes a la glucosa tenían un canal de sustrato más profundo y más estrecho que otras β-glucosidasas y que este canal restringía el acceso de la glucosa al sitio activo de la enzima.

Las β-glucosidasas menos tolerantes a la glucosa tenían un canal de entrada al sitio activo menos profundo pero más ancho, permitiendo que más glucosa producida por estas enzimas entre en la última etapa de degradación de la biomasa. La glucosa retenida bloquea el canal de la proteína y reduce su actividad catalítica.

Basado en esta observación, Los investigadores utilizaron una técnica de biología molecular conocida como mutagénesis dirigida al sitio para reemplazar dos aminoácidos que podrían estar actuando como "guardianes" en la entrada al sitio activo de la enzima. dejando entrar glucosa o bloqueándola. El análisis de sus experimentos mostró que la modificación redujo el canal al sitio activo.

"El sitio activo de la enzima mutante se redujo a un tamaño similar al de las β-glucosidasas GH1 tolerantes a la glucosa, "Dijo Santos.

Eficiencia mejorada

Los investigadores llevaron a cabo una serie de experimentos para medir el rendimiento de la proteína mejorada en la descomposición de la biomasa, especialmente bagazo de caña de azúcar, un residuo agroindustrial con gran potencial de uso rentable en Brasil. Durante una pasantía de investigación en el extranjero con una beca de la Fundación de Investigación de São Paulo — FAPESP, Santos trabajó con un grupo de investigación dirigido por Paul Dupree, profesor de la Universidad de Cambridge en el Reino Unido, en un análisis de la eficiencia de liberación de glucosa de la enzima adaptada cuando se convirtieron diferentes fuentes de biomasa vegetal.

El análisis mostró que la eficacia catalítica de la enzima modificada era un 300% mayor que la de la enzima de tipo salvaje en términos de liberación de glucosa. Es más, era más tolerante a la glucosa, por lo que se liberó más glucosa de todas las materias primas de biomasa vegetal probadas. La mutación también mejoró la estabilidad térmica de la enzima durante la fermentación.

"La mutación de los dos aminoácidos en el sitio activo hizo que la enzima fuera supereficiente. Está lista para su aplicación industrial, "dijo Anete Pereira de Souza, profesor de la UNICAMP e investigador principal del proyecto. "Una de las ventajas de la enzima es que se produce in vitro y no a partir de un hongo modificado u otro organismo, por lo que puede producirse en masa a un costo relativamente bajo ".