Las nanomáquinas de proteínas compuestas por múltiples moléculas de proteínas son altamente dinámicas durante sus acciones sobre sus objetivos funcionales, en ocasiones llamados sustratos. La dinámica de estas grandes nanomáquinas de proteínas de más de un peso molecular de megadalton es refractaria al análisis estructural mediante la tecnología existente, como la cristalografía de rayos X y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear. Microscopía crioelectrónica (crio-EM), una tecnología emergente para la determinación de estructuras de alta resolución, tiene potencial para visualizar la dinámica de grandes nanomáquinas de proteínas, pero las reconstrucciones crio-EM existentes de estructuras altamente dinámicas se han limitado a una resolución moderada a baja.

Los científicos han soñado durante mucho tiempo con la decodificación de la dinámica de grandes máquinas moleculares de tamaños de megadalton en detalle atómico, el determinante último de sus funciones biológicas. Ahora, un equipo de biofísicos de la Universidad de Pekín, Dana-Farber Cancer Institute y Harvard Medical School han utilizado crio-EM para visualizar la dinámica a nivel atómico del proteasoma de 2,5 megadalton, la máquina de degradación de proteínas más grande conocida en células eucariotas, durante su acción quimio-mecánica sobre un sustrato proteico. Reconstruyeron un procedimiento dinámico casi completo de procesamiento de sustrato en el proteasoma humano con una resolución sin precedentes que permitió la determinación de detalles atómicos en 3-D, similar a filmar átomo por átomo una película en 3D.

"Este trabajo allana el camino para estudiar la termodinámica de nanomáquinas de megadalton con precisión atómica lejos del equilibrio, "dijo Youdong Mao, un biofísico y autor correspondiente en un nuevo artículo revolucionario publicado en el primer número de la revista Naturaleza en 2019. "Este estudio abre numerosas posibilidades para el descubrimiento de fármacos basados ​​en estructuras dirigidos al proteasoma humano para el tratamiento del mieloma múltiple y enfermedades neurodegenerativas".

El sistema de ubiquitina-proteasoma (UPS) es la vía de degradación de proteínas más importante en las células. Mantiene el equilibrio de los materiales proteicos en las células vivas, y juega un papel crucial en la rápida degradación de proteínas reguladoras, proteínas mal plegadas o proteínas dañadas. UPS está involucrado en posiblemente todos los procesos celulares, como el ciclo celular, regulación de la expresión génica, etc. El metabolismo anormal de las proteínas causado por el trastorno de UPS está directamente relacionado con muchas enfermedades humanas, incluido el cáncer. En 2004, Aaron Ciechanover, Irwin Rose y Avram Hershko fueron galardonados con el Premio Nobel de Química por su descubrimiento de esta vía de degradación. En el corazón del UPS se encuentra el proteasoma responsable de la descomposición de los sustratos etiquetados con ubiquitina. Es una de las gigantescas máquinas holoenzimáticas en las células más fundamentales y complicadas. La holoenzima del proteasoma humano contiene al menos 33 tipos de subunidades diferentes con un peso molecular total de aproximadamente 2,5 megadalton. También se conoce como el objetivo directo de varios medicamentos de molécula pequeña aprobados por la FDA de Estados Unidos para tratar el mieloma múltiple.

Usando cryo-EM en combinación con tecnología de aprendizaje automático, El equipo determinó las estructuras dinámicas del proteasoma humano comprometido con el sustrato en siete estados conformacionales intermedios con una resolución de 2.8-3.6 Å. capturado durante la descomposición de una proteína poliubiquitilada. En esta resolución, el equipo pudo identificar iones de magnesio únicos unidos tanto a ATP como a ADP en los mapas de densidad crio-EM. Estas estructuras tridimensionales iluminan un notable continuo espacio-temporal de interacciones dinámicas sustrato-proteasoma.

Curiosamente, el equipo descubrió que el inicio de la translocación del sustrato está ampliamente coordinado con otros eventos reguladores dinámicos que preparan el proteasoma para la degradación procesiva del sustrato. Mediante un análisis más sistemático, el equipo descubrió cómo la energía química de la hidrólisis del ATP se convierte en el trabajo mecánico del sustrato que se despliega a través de un proceso altamente concertado de cambios conformacionales de múltiples proteínas.

Su hallazgo proporciona nuevos conocimientos sobre el ciclo completo de procesamiento del sustrato y sugiere distintos modos seguidos de hidrólisis de ATP en la holoenzima del proteasoma. Se cree que es la primera vez que se visualiza a nivel atómico un ciclo completo de hidrólisis secuencial de ATP en un motor heterohexámero AAA-ATPasa. Esto resuelve un debate científico de larga data sobre los hexámeros de ATPasa entre dos modelos hipotéticos, uno sugiere hidrólisis secuencial de ATP y el otro supone eventos hidrolíticos aleatorios en el anillo hexamérico. Notablemente, el equipo observó tres modos principales de hidrólisis de ATP altamente coordinada, con eventos hidrolíticos en dos ATPasas en posiciones opuestas, en dos ATPasas adyacentes, y en una ATPasa a la vez. Estos modos hidrolíticos regulan elegantemente la desubiquitilación, iniciación de la translocación, y desdoblamiento procesivo de sustratos, respectivamente.

El equipo notó ciertas limitaciones en este estudio, incluyendo que la multiplicidad de eventos de procesamiento de nucleótidos en distintas ATPasas durante las transiciones entre estados consecutivos del proteasoma puede haber resultado en la ausencia de pasos rápidos y estados intermedios escasamente poblados en sus reconstrucciones crio-EM. El equipo prevé la posibilidad de nuevas exploraciones a este respecto mediante la identificación de estos intermediarios faltantes para aclarar cómo los eventos hidrolíticos de ATP y el intercambio de nucleótidos se coordinan entre sí. y ligado alostéricamente a la translocación del sustrato. "Se requiere un mayor desarrollo en la tecnología de análisis de datos para extraer información aún más dinámica del mismo conjunto de datos, ", Dijo Mao." Hay un largo camino por recorrer para que la tecnología de aprendizaje automático impulsada por datos desate completamente el poder potencial de la crio-EM en la resolución de la dinámica compleja de las máquinas moleculares de megadalton ".