Estructura molecular del nuevo agente de marcaje fluorescente en el infrarrojo cercano PREX 710 con un sitio de enlace para una biomolécula. La incorporación del resto de óxido de fosfina captador de electrones (P =O) en la estructura del xanteno permite el desplazamiento hacia el rojo (aumento de la longitud de onda) de las longitudes de onda de excitación y emisión. Los dos grupos metoxi (OMe) del anillo aromático contribuyen a la mejora de la estabilidad química y la fotoestabilidad de PREX 710. Se pueden unir varias biomoléculas a PREX 710 en la posición R mediante un enlace amida. Crédito:Universidad de Nagoya
Un grupo de químicos del Instituto de Bio-Moléculas Transformadoras (ITbM), Universidad de Nagoya, ha desarrollado un nuevo tinte fluorescente fotoestable que emite infrarrojo cercano (NIR) PREX 710 (tinte de xanteno fotorresistente que puede excitarse a 710 nanómetros) para tener usos que van desde imágenes de moléculas individuales a largo plazo hasta imágenes profundas in vivo, según un estudio publicado en la revista Edición internacional Angewandte Chemie .
PREX 710 tiene una estructura molecular que consiste en un resto de óxido de fosfina (P =O) en lugar de oxígeno en su núcleo de xanteno tricíclico fusionado, y 2 grupos metoxi (OMe) en el anillo aromático periférico, que permite que el tinte absorba y emita en la región NIR, y explica su alta química y fotoestabilidad, respectivamente. Además, el éster PREX 710 NHS se puede unir químicamente a biomoléculas que incluyen proteínas, azúcares y pequeños ligandos orgánicos, lo que puede conducir a observaciones de diversas estructuras y eventos en células vivas.
Junto con los investigadores de RIKEN y la Universidad Ehime, El equipo ha descubierto que PREX 710 podría utilizarse para obtener imágenes fluorescentes de una sola molécula en condiciones fisiológicas. La alta fotoestabilidad de PREX 710 permite obtener imágenes repetidas, y sus propiedades específicas de absorción / emisión de luz en la región NIR, permite la obtención de imágenes multicolor con su uso con otros tintes fluorescentes. Es más, uniendo el éster PREX 710 NHS a un polisacárido (dextrano), El equipo logró la obtención de imágenes in vivo en profundidad en 3D de vasos sanguíneos en cerebros de ratones. Esto fue posible gracias a la alta estabilidad química de PREX 710 dentro del torrente sanguíneo, así como por el uso de radiación NIR para mirar profundamente dentro de los tejidos. La alta fotoestabilidad, solubilidad en agua y estabilidad química, junto con su baja citotoxicidad, y el uso de radiación NIR convierte a PREX 710 en una poderosa herramienta para visualizar procesos y estructuras moleculares durante períodos prolongados sin fotoblanqueo dentro de los organismos vivos.
La formación de imágenes por fluorescencia es una técnica en la que una proteína específica o un orgánulo celular se marca con una sonda fluorescente y se utiliza para visualizar procesos y estructuras de organismos bajo un microscopio fluorescente. Aunque muchos agentes marcadores fluorescentes, como proteínas fluorescentes y pequeñas moléculas orgánicas fluorescentes se han desarrollado hasta ahora, la mayoría usa radiación en la región visible. Las desventajas de usar luz visible como la luz azul o verde surgen de su alta energía, que pueden dañar las muestras vivas cuando se exponen durante períodos prolongados. Además, cuando las muestras se excitan con luz visible, la autofluorescencia de las propias muestras tiende a interferir con las señales de las sondas fluorescentes. También se sabe que las biomoléculas como la hemoglobina tienden a absorber la luz visible, para que la luz no penetre profundamente en los organismos, lo que ha hecho que sea difícil visualizar vasos sanguíneos y órganos vivos.
Una comparación de la fotoestabilidad de PREX 710 y Alexa Fluor 647 (tinte de cianina) utilizando imágenes fluorescentes de una sola molécula. Los tintes fluorescentes se conjugaron con NeutrAvidin inmovilizado sobre una superficie de vidrio biotinilada. Cada punto brillante indica una señal de fluorescencia de una sola molécula. En el cubreobjetos con Alexa Fluor 647, la mitad de las señales desaparecen en 20 segundos. Por otra parte, el cubreobjetos con PREX 710 retiene el 80% de las señales incluso después de 2 minutos. Crédito:Universidad de Nagoya
Estos problemas que surgen de la obtención de imágenes con luz visible podrían superarse utilizando radiación NIR, que tiene una longitud de onda más larga, por lo tanto, menor energía, en comparación con la luz visible. Sin embargo, muchos de los tintes NIR desarrollados hasta ahora se basan en tintes de cianina, que consisten en cadenas de polimetino (grupos de metino (CH) conectados por enlaces simples y dobles alternos) que tienen heterociclos que contienen nitrógeno unidos a cada extremo de la cadena. La mayoría de los tintes de cianina sufren de baja estabilidad química y fotoestabilidad, dificultando así la obtención de imágenes biológicas a largo plazo con estos tintes debido al fotoblanqueo con el tiempo. Aunque se pueden agregar agentes anti-decoloración para prevenir el fotoblanqueo, pueden no ser aplicables en experimentos con células vivas.
"El grupo Yamaguchi se ha interesado en fabricar tintes fotoestables para bioimagen que absorban y emitan en diferentes longitudes de onda, "dice el Dr. Masayasu Taki, profesor asociado en el grupo del profesor Shigehiro Yamaguchi en ITbM, y uno de los líderes de este estudio. "Se sabe que las longitudes de onda de excitación y emisión de los tintes aumentan con un aumento de dobles enlaces conjugados en su estructura, pero más anillos complica la síntesis y también conduce a una baja solubilidad en agua, que no es ideal para la obtención de imágenes en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, decidimos sintetizar diferentes tintes cambiando los elementos del anillo de xanteno del núcleo de oxígeno a fósforo ".
"Dr. Marek Grzybowski, un investigador postdoctoral en nuestro grupo, ha estado trabajando en este proyecto, y ha ideado la síntesis de muchos de los tintes fluorescentes a base de rodamina desarrollados recientemente en nuestro grupo, "describe Taki.
Durante sus estudios, el grupo también encontró que uno de los derivados de PREX 710 era susceptible al ataque hacia una forma reducida de glutatión (GSH), que es un tripéptido que actúa como antioxidante en las células. Aunque la decoloración de tintes por GSH generalmente se considera un inconveniente en las imágenes fluorescentes en vivo, el grupo pensó que este tinte podría servir como una sonda NIR prometedora para monitorear el nivel de GSH en células y tejidos vivos.
Ejemplos de imágenes fluorescentes con PREX 710. La imagen de la izquierda muestra la membrana celular de una célula HeLa viva (cian), núcleo (verde amarillo) y mitocondrias (rojo) teñidos con DiI, SiR-DNA y PREX 710, respectivamente. PREX 710 se puede utilizar simultáneamente con sondas fluorescentes disponibles comercialmente para permitir la obtención de imágenes multicolores. La imagen 3D de la derecha muestra vasos sanguíneos en el cerebro de un ratón teñidos con un conjugado PREX 710-dextrano que se inyectó en el torrente sanguíneo. Crédito:Universidad de Nagoya
"Después de sintetizar y probar varios derivados de xanteno, encontramos PREX 710, que exhibió una estabilidad química y fotoestabilidad excepcionales, y por lo tanto demostró ser un fluoróforo emisor de NIR práctico, que a su vez es permeable a la membrana y se localiza principalmente en las mitocondrias de las células HeLa vivas, "explica Taki." Estábamos muy emocionados de ver que al usar PREX 710, pudimos visualizar componentes de células vivas durante muchos minutos en comparación con solo unos pocos segundos que se podrían lograr con tintes convencionales ".
En colaboración con el Dr. Yasushi Okada, un líder de equipo en el Centro RIKEN de Investigación de Dinámica de Biosistemas, el equipo encontró que PREX 710 es aplicable para imágenes fluorescentes de una sola molécula, una técnica que se sabe que requiere una fuerte radiación de luz. Sus estudios muestran que en las mismas condiciones experimentales, El 80% de las señales fluorescentes de una sola molécula de PREX 710 pudieron detectarse durante 2 minutos, mientras que la mitad de las señales desaparecieron en 20 segundos con Alexa Fluor 647 (tinte de cianina). Los experimentos demuestran que PREX 710 puede visualizar claramente cada molécula durante períodos prolongados sin fotoblanqueo en ausencia de agentes anti-decoloración.
Además, el equipo pudo utilizar PREX 710 en la obtención de imágenes multicolores de células HeLa vivas. Dado que las propiedades de excitación y emisión NIR de PREX 710 difieren de los tintes fluorescentes de luz visible, Se puede evitar la diafonía espectral para visualizar los componentes celulares, cada uno de ellos teñido con tintes diferentes. Por ejemplo, Fue posible obtener imágenes multicolores de células HeLa vivas al teñir la membrana celular, núcleo y mitocondrias con tintes fluorescentes disponibles comercialmente como DiI y SiR-DNA, junto con PREX 710, respectivamente.
La utilidad práctica de PREX 710 también se demostró aplicando la sonda para la obtención de imágenes profundas in vivo, que se llevó a cabo en colaboración con los Dres. Takeshi Imamura y Ryosuke Kawakami de la Universidad Ehime. Usando el sitio de bioconjugación de PREX 710, dextrano, un polisacárido compuesto por moléculas de glucosa, se marcó con fluorescencia y se inyectó en el torrente sanguíneo a través de la vena de la cola del ratón. La imagen tridimensional de los vasos sanguíneos en el cerebro del ratón podría construirse debido al alto brillo de PREX 710 en la región NIR que permite el registro de las señales de fluorescencia en el tejido profundo.
“Nos complace demostrar que PREX 710 y sus derivados son herramientas útiles para la investigación de la dinámica de los organismos vivos, tejidos, células, y moléculas, ", dice Taki." Actualmente estamos trabajando en el desarrollo de otras sondas de fluorescencia NIR que podrían usarse para teñir proteínas específicas, así como para examinar estructuras y procesos vivos con mayor profundidad. Esperamos que esto conduzca a la visualización y elucidación de varios fenómenos en los sistemas vivos, incluyendo síntomas médicos, " él dice.
