Se puede hacer que un tipo modificado de la proteína Eos emita fluorescencia cuando se ilumina con luz láser azul y roja. Antecedentes:dos proteínas del citoesqueleto en azul y rojo. La proteína visible en rojo se marcó con el nuevo tipo Eos modificado. (Montaje:Mohr MA et al. Angewandte Chemie 2017. Copyright Wiley-VCH. Reproducido con permiso)
Los científicos han identificado el mecanismo que permite que las proteínas fluorescentes cambien de color en dos fases. De este modo, están sentando las bases para nuevas aplicaciones en microscopía y análisis funcionales en la investigación biológica.
Todo comenzó con una observación que los científicos de ETH hicieron hace unos dos años con una proteína fluorescente especial aislada de los corales. Dendra 2, que se vuelve verde fluorescente. La luz se puede utilizar para cambiar su estructura molecular de modo que cambie su color a rojo. Los investigadores descubrieron una nueva forma de inducir este cambio de color:primero, se excita brevemente con un pulso de luz láser azul y luego se ilumina inmediatamente con luz infrarroja cercana. Las aplicaciones de este conmutador de color de dos fases incluyen microscopía de fluorescencia.
Un equipo internacional de investigadores dirigido por Periklis Pantazis, del Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas (D-BSSE) en ETH Zurich en Basilea, ahora ha explicado este mecanismo de cambio de color de dos fases. Los científicos se refieren a esto como "conversión preparada". El nuevo conocimiento permite a los investigadores modificar otras proteínas sensibles a la luz para que también puedan excitarse en dos fases.
Los investigadores de ETH Zurich, el Instituto de Tecnología de Karlsruhe, y el campus de investigación Janelia en Ashburn, Virginia, examinó de cerca las proteínas activadas con luz azul y logró mostrar que estas proteínas entran en un estado excitado que dura varios milisegundos. "Eso es relativamente largo, "explica Pantazis." Otros fenómenos de fluorescencia son mucho más cortos ".
Los científicos también demostraron que este estado es un caso de un fenómeno conocido de la química cuántica:un "estado triplete". Después de unos cinco milisegundos, la proteína fluorescente Dendra 2 vuelve a su estado fundamental. La conversión preparada ocurre solo si la segunda fase (iluminación con luz infrarroja cercana) ocurre dentro de la ventana de tiempo del triplete.
Secuencias de aminoácidos modificadas
La duración del estado triplete depende en gran medida de la estabilidad de la proteína fluorescente. Esta, Sucesivamente, depende de la secuencia exacta de los componentes básicos de las proteínas (aminoácidos), razón por la cual los científicos modificaron la secuencia de aminoácidos de Dendra 2 en varios puntos. Luego, hicieron lo mismo con otra proteína fluorescente, Eos. Hasta ahora, esta proteína no se pudo excitar en dos fases. Está documentado en la literatura científica que estas localizaciones son esenciales para el estado triplete.
Cuando Dendra 2 (a la derecha con su compuesto químico fluorescente) se ilumina con luz láser azul, se vuelve verde fluorescente. Con luz violeta, cambia su estructura química de modo que solo puede emitir fluorescencia roja. Este cambio de estructura química también ocurre cuando se ilumina brevemente con azul e inmediatamente después con luz roja (o con luz láser azul y roja simultáneamente). Crédito:ETH Zurich
Los científicos midieron la duración del estado triplete con todas las nuevas proteínas. Este estado se extendió significativamente en varias de las proteínas probadas. Los científicos también pudieron modificar la proteína Eos para que también pudiera activarse en dos fases. Lo lograron con otras seis proteínas que nunca antes se habían activado en dos fases. "Las proteínas modificadas no solo se hicieron intercambiables en dos fases por primera vez; también son más estables y, por lo tanto, tienen una fluorescencia más intensa, "dice Manuel Mohr, estudiante de doctorado en el grupo de Pantazis y autor principal del estudio.
Los científicos hicieron el descubrimiento original con un láser que no está disponible convencionalmente, que utiliza luz en el rango del infrarrojo cercano. Hoy dia, sin embargo, Los científicos han demostrado que el efecto también se puede lograr utilizando los mismos láseres rojos convencionales que se encuentran en todos los microscopios de fluorescencia. En otras palabras, La conversión cebada es posible con cualquier microscopio de fluorescencia.
La conversión preparada se puede utilizar en microscopía para marcar un punto estrechamente definido en una muestra de tejido. Los científicos hacen esto apuntando un rayo láser azul y rojo al tejido para que los rayos se crucen en un solo punto. La conversión preparada ocurre solo en esta intersección. "Debido a que ni la luz láser azul ni la roja tienen un efecto tóxico, el método es ideal para organismos vivos, ", dice Pantazis. Las aplicaciones con otras técnicas de microscopía también pueden ser posibles, including super-resolution microscopy, which has been around for several years now.
Brain mapping and gene sequencing
"We now know how to modify photoconvertible proteins to make them switch in two phases, " says Pantazis. The ETH scientists are working together with protein experts to modify other fluorescent proteins used in microscopy in the same way.
The researchers recently modified proteins so that they can be split off from a gene-activating messenger in a way that allows them to be light-activated with two colours. Por ejemplo, they could illuminate tissue with a blue and red beam intersecting at a single point, making it possible to activate specific genes in a single cell of the tissue. Proteins that detect calcium can be modified in this way, as well, and could potentially be used for 3-D brain mapping.
Biologists can ultimately use the new technique for other functional analyses in 3-D. ETH Zurich has already issued several licences for the patent, including to a start-up that plans to develop a DNA sequencing technique using a 3-D matrix.
