Western Blot es uno de los procedimientos más comunes en los laboratorios bioquímicos. Básicamente, separa las proteínas de una muestra por tamaño, luego las pruebas usan anticuerpos para determinar si una proteína dada está presente. Es útil no solo en investigación sino también en laboratorios médicos o de diagnóstico; las pruebas para el VIH y la enfermedad de Lyme, por ejemplo, implican un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), seguido de una transferencia Western si el ELISA da positivo. A pesar de su popularidad, sin embargo, el Western Blot tiene varias desventajas.
Nonquantitative
Las Western Blots clásicas no son cuantitativas. En otras palabras, si bien pueden decirles a los investigadores si una proteína en particular está presente, no permiten cuantificar la cantidad de proteína presente. Algunas compañías de biotecnología ahora venden kits que permiten a los investigadores o técnicos de laboratorio cuantificar la cantidad de proteína presente usando una curva estándar, pero esto solo funciona si hay muestras puras de la misma proteína disponibles. Además, el peso molecular de una proteína solo puede estimarse con Western blotting, en lugar de determinarse exactamente como con la espectrometría de masas.
Antibodies
Una inmunotransferencia de Western solo puede realizarse si los anticuerpos primarios contra el proteína de interés están disponibles. Mientras que los anticuerpos para muchas proteínas diferentes están disponibles en las compañías de biotecnología, no son baratos; si los anticuerpos primarios no están disponibles para una proteína dada, no será posible realizar una transferencia Western buscando esa proteína particular. Además, los investigadores pueden querer determinar si una proteína ha sido modificada de alguna manera, si ha sido fosforilada (por ejemplo, tenía un grupo fosfato unido) y con la técnica de transferencia Western necesitan anticuerpos específicos para la proteína modificada. proteína.
Capacitación
Puede ser un desafío realizar una transferencia Western correctamente y obtener buenos resultados, por lo que el personal debe estar bien capacitado. En esto como en muchas otras cosas, la experiencia es tal vez el mejor tutor; incluso para un técnico experimentado, sin embargo, una transferencia Western consume mucho tiempo. La porción de electroforesis en gel del experimento, por ejemplo, típicamente tomará de una a dos horas para ejecutarse. Se pueden realizar otras tareas mientras se está ejecutando el gel, por supuesto, pero el experimento aún lleva bastante tiempo para obtener resultados.
Otras limitaciones
Los anticuerpos a veces exhiben algo de unión fuera del objetivo, que puede hacer que los resultados sean más pobres Además, con Western blot, utiliza un anticuerpo contra una proteína específica, por lo que sus resultados solo le indicarán si esa proteína estaba presente. Por el contrario, la espectrometría de masas de alta resolución revela todas las proteínas presentes en una muestra y, a diferencia de la transferencia Western clásica, es cuantitativa. Es importante recordar, por supuesto, que la espectrometría de masas es mucho más costosa y también más desafiante desde el punto de vista técnico en comparación con la transferencia Western.
