Según el sitio web BioWeb de la Universidad de Wisconsin, un cebador de PCR es un oligonucleótido sintético corto (generalmente entre 18 y 25 bases de longitud) utilizado para amplificar regiones específicas de ADN en una técnica de biología molecular conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Se necesitan tanto cebadores directos como retrospectivos, diseñados para ser complementos inversos de la cadena de ADN, para flanquear y unirse a la región de ADN deseada. Cuando los científicos quieren realizar una investigación sobre un gen específico o una región de ADN, primero deben realizar una PCR para adquirir la región objetivo con la que trabajarán. Diseñar secuencias de cebadores para la región de interés puede ser necesaria si todavía no están disponibles a través de investigaciones publicadas previamente o por medios comerciales.
Obtenga la secuencia de nucleótidos del gen o región de ADN de interés y decida cuánto tiempo un fragmento quieres amplificar El cebador directo e inverso está diseñado para unirse al principio y al final del fragmento deseado. Típicamente, los métodos de PCR convencionales utilizan cebadores que flanquean una región de entre 100 y 1.000 pares de bases de longitud, mientras que los métodos de PCR en tiempo real usan fragmentos de aproximadamente 50 a 200 pares de bases de longitud.
Decidir en qué secuencia de la secuencia quieres los cebadores mentir. Por ejemplo, puede querer la ubicación cerca del 5 'o el 3' final de la secuencia o en el medio. Si lo desea, designe la ubicación de los cebadores para abarcar un intrón.
Siga las pautas recomendadas para el diseño del cebador. La amplificación exitosa del producto de ADN depende de la calidad de los iniciadores y ciertas variables son críticas.
Los cebadores de diseño tienen una longitud de 18 a 24 bases. Vincent R. Prezioso, Ph.D., de Brinkmann Instruments Inc., sugiere que esta longitud es lo suficientemente larga como para ser extremadamente específica para la región de ADN deseada, pero lo suficientemente corta como para unirse (recocer) fácilmente. La temperatura de fusión del cebador (Tm) debe estar entre 55 y 80 grados Celsius, lo suficientemente baja como para permitir una fusión completa a 90 grados Celsius o más, pero lo suficientemente alta como para permitir el recocido. El contenido de GC (porcentaje de Gs y Cs en la secuencia) debe estar entre 40 y 60 por ciento. El extremo 3 'de la secuencia del cebador debe terminar en una C o una G (llamada clamp GC) para promover la unión, ya que los nucleótidos G y C tienen enlaces más fuertes, sin embargo, evite tener tres o más Gs o Cs en los últimos cinco bases de la secuencia.
Evite tener ejecuciones de cuatro o más de una base (como ACCCC ...) o cuatro o más repeticiones de di-nucleótidos (como ATATATAT ...) porque pueden causar la formación de gotas erróneas. Diseñar cebadores sin homología intra-cebador (más de tres bases que se complementan dentro del mismo cebador) o homología entre cebadores (donde el cebador directo e inverso tienen secuencias complementarias). Esto puede causar dímeros propios o dímeros de cebadores, donde los cebadores se unen a sí mismos en lugar de unirse a la secuencia de ADN deseada.
Use recursos en línea y sitios web que ayuden en el diseño de cebadores o ayude a complementariedad o el potencial de hacer estructuras secundarias como horquillas. Algunos sitios web de diseño de cebadores incluyen Primer3 del Instituto de Tecnología de Massachusetts, Primer-Blast de National Center for Biotechnology Information y OligoAnalyzer de Integrated DNA Technologies.
