3PA tiene varias ventajas potenciales para la obtención de imágenes biológicas sobre 1PA y 2PA. En primer lugar, el 3PA puede proporcionar una penetración más profunda en el tejido porque la luz de longitud de onda más larga utilizada para el 3PA se dispersa y absorbe menos por los componentes del tejido, como el agua y la hemoglobina. En segundo lugar, el 3PA se puede utilizar para excitar la fluorescencia en moléculas específicas con alta selectividad porque la longitud de onda de excitación se puede ajustar con precisión para que coincida con el espectro de absorción de la molécula objetivo. En tercer lugar, 3PA puede generar imágenes de mayor resolución porque el volumen focal más pequeño utilizado para la microscopía 3PA produce menos fotoblanqueo y fotodaño a la muestra.
A pesar de estas ventajas potenciales, 3PA todavía no se utiliza ampliamente para la obtención de imágenes biológicas debido a varios desafíos. En primer lugar, la eficiencia del 3PA suele ser muy baja y requiere altas potencias del láser que pueden dañar las muestras biológicas. En segundo lugar, la longitud de onda de excitación del 3PA suele estar en el rango ultravioleta (UV), lo que puede ser perjudicial para las células. En tercer lugar, el desarrollo de sondas 3PA adecuadas se encuentra todavía en sus primeras etapas.
A medida que se superen estos desafíos, es probable que 3PA se convierta en una herramienta más importante para la bioimagen. Su combinación única de penetración profunda en el tejido, alta selectividad y alta resolución lo hace ideal para una variedad de aplicaciones, incluidas imágenes in vivo, transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) y microscopía de súper resolución.
A continuación se muestran algunos ejemplos específicos de cómo se ha utilizado 3PA para la obtención de bioimágenes:
* Se ha utilizado microscopía 3PA para obtener imágenes de los vasos sanguíneos del cerebro de un ratón vivo. La señal 3PA fue generada por un tinte fluorescente que fue captado específicamente por las células endoteliales, las células que recubren los vasos sanguíneos. Este estudio demostró el potencial de 3PA para obtener imágenes in vivo de estructuras de tejido profundo.
* 3PA FRET se ha utilizado para estudiar las interacciones de proteínas en células vivas. En esta técnica, se unen dos tintes fluorescentes diferentes a dos proteínas de interés diferentes. Cuando las proteínas interactúan, los tintes se acercan y la señal 3PA de un tinte se transfiere al otro tinte. Esto permite a los investigadores monitorear las interacciones de las proteínas en tiempo real y con alta resolución espacial.
* La microscopía de superresolución 3PA se ha utilizado para obtener imágenes de estructuras en células con una resolución de menos de 100 nanómetros. Esta técnica combina la alta resolución de la microscopía 3PA con las capacidades de superresolución de técnicas como la microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM).
Estos ejemplos demuestran el potencial de 3PA para la bioimagen. A medida que se superen los desafíos asociados con 3PA, es probable que esta técnica se vuelva cada vez más importante para una variedad de aplicaciones en investigación biomédica y diagnóstico clínico.
