Los investigadores suelen estudiar biomoléculas como proteínas o aminoácidos uniendo químicamente un "fluoróforo", una molécula sensible que absorbe y reemite energía de la luz.
Cuando se activan con un láser y se obtienen imágenes a través de un microscopio de alta potencia, estas etiquetas o etiquetas de fluoróforo explotan en un arco iris de color e información. Proporcionan una gran cantidad de información que puede, por ejemplo, ayudar a detectar enfermedades o identificar condiciones genéticas.
Para detectar más de un tipo de molécula a la vez, o mediciones "múltiples", se utilizan tipos adicionales de fluoróforos que emiten diferentes colores de luz. Pero es sorprendentemente difícil distinguir diferentes colores a nivel de una sola molécula. Esta es la razón por la que la mayoría de los microscopios sólo observan de tres a cuatro colores.
Los investigadores pueden romper esta barrera del color utilizando técnicas avanzadas que implican rondas de etiquetado e imágenes de varios días de duración o emplear configuraciones complicadas con muchos láseres. Sin embargo, encontrar una forma sencilla y rápida de ver muchos colores sigue siendo un gran desafío.
Los investigadores de la Escuela de Ingeniería Molecular Pritzker de la Universidad de Chicago tienen una solución novedosa para este desafío, descrita en un artículo publicado hoy en Nature Nanotechnology. . Una nueva técnica descrita por Squires Lab utiliza tres componentes químicos simples para diseñar docenas de etiquetas "FRETfluor", creando un espectro de colores más hermoso y matizado que los investigadores pueden usar para etiquetar biomoléculas.
"Nuestro enfoque es más fácil. Es una toma de etiquetado, una toma de imágenes", dijo el coprimer autor Jiachong Chu, Ph.D. en Ingeniería Molecular Pritzker de la UChicago. candidato. "Eso significa que puedes hacer más con menos. Actualmente, nuestra novedosa técnica es la mejor en el campo".
Las moléculas individuales son pequeñas y las muestras de células son comparativamente enormes, complicadas y confusas. El objetivo final de esta área de investigación, que el artículo del equipo de PME sitúa más cerca que nunca, es la multiplexación.
"Multiplexar muestras significa poder, en la misma medición, medir más de una especie de molécula, de modo que tal vez tengas 10 o 50, o cientos de proteínas diferentes que quieras identificar", dijo Allison, profesora asistente de ingeniería molecular de la familia Neubauer. Escuderos. "Con esta nueva técnica, podemos hacer docenas. Creo que podemos ampliarlo a cientos".
Para afrontar este desafío, el equipo de Squires Lab encontró una nueva forma innovadora de utilizar una técnica bien establecida:Förster Resonance Energy Transfer o FRET. FRET es un mecanismo que describe cómo se transfiere energía entre moléculas sensibles a la luz. Es una forma que tienen los investigadores de medir la distancia entre diferentes partes de una molécula o de informar cuándo interactúan dos moléculas. Las señales FRET son excepcionalmente sensibles a las propiedades de los fluoróforos participantes, que el equipo de UChicago utilizó para ajustar sus etiquetas FRETfluor.
"Este proyecto utiliza FRET de una manera nueva", dijo la coautora Ayesha Ejaz, Ph.D. Candidato en Química. "FRET se usa comúnmente para medir distancias y observar la dinámica en biomoléculas. Cambiamos el espacio entre un tinte donante y aceptor para crear diferentes eficiencias de FRET y otras propiedades que usamos para identificar las diferentes construcciones".
Las 27 etiquetas utilizadas en la investigación del equipo de PME fueron 27 "FRETfluores" que diseñaron utilizando una combinación simple de ADN, un tinte de cianina verde (Cy3) y un tinte de cianina rojo (Cy5). Además de brillar en diferentes colores, los FRETfluores exhiben otras propiedades ajustables, como el momento en que se emiten los fotones o cuáles son las orientaciones de estos fotones.
Juntas, estas propiedades se pueden utilizar para identificar un FRETfluor en solo una fracción de segundo, en concentraciones ultrabajas. Ejaz dijo que una posible dirección futura para esta investigación es reemplazar eventualmente las etiquetas de fluoróforo ordinarias con estos FRETfluores.
"Por lo general, cuando las personas quieren observar varias cosas, como diferentes partes de una célula, a la vez, etiquetan cada componente con una etiqueta fluorescente diferente que emite un determinado color de luz. Pero las etiquetas fluorescentes se limitan a cuatro o cinco colores. ", dijo Ejaz.
"Si en su lugar se pueden utilizar FRETfluors, entonces podremos aumentar el número de 'colores' disponibles para la microscopía de fluorescencia. Actualmente estamos probando qué tan bien funcionan los FRETfluors en diferentes tipos de experimentos y entornos, lo que nos permitirá comprender mejor todos las posibilidades."
"Estoy emocionada de ver los FRETfluors en acción", dijo.
Para Squires, gran parte del atractivo de la nueva técnica de multiplexación proviene de la sensibilidad combinada con la simplicidad.
"Todo el mundo quiere multiplexar su ensayo favorito y existen muchas estrategias que funcionarán en determinadas situaciones", dijo. "Hay técnicas que funcionan bien cuando tienes mucho tiempo o cuando tu muestra está muerta y nada se mueve.
"Estamos atacando el problema en el que no tienes mucho tiempo. Quieres saber qué enfermedad tiene alguien mientras todavía hay tiempo para combatirla, o tienes sólo una pequeñísima muestra y recibes una inyección para identificarla. cada molécula a medida que fluye a través de su canal. Podemos identificar FRETfluores en una fracción de segundo hasta concentraciones de decenas de femtomolares."
La simplicidad es clave, tanto al utilizar productos químicos comunes para fabricar FRETfluors como al ser pionero en una técnica que solo necesita un láser para la lectura.
"Sólo etiquetamos el objetivo una vez y sólo hacemos la lectura una vez", dijo Chu. "Bajo ese contexto, podemos crear 27 etiquetas diferentes que se pueden usar al mismo tiempo".
Squires describió cómo las técnicas existentes podrían usarse junto con FRETfluors para obtener más ganancias de multiplexación ("se podrían introducir esquemas sofisticados de excitación láser o incorporar otros fluoróforos que tengan propiedades ligeramente diferentes") que mejorarían las lecturas de las etiquetas existentes.
La aplicación de estos multiplicadores a su técnica nueva y más poderosa, afirmó Squires, puede abrir mundos de nuevas investigaciones y aplicaciones.
"Estas mejoras en los ensayos biomédicos basados en flujo y en imágenes permitirán la próxima generación de innovación", afirmó Squires.
Más información: Jiachong Chu et al, Multiplexación de fluorescencia de una sola molécula mediante detección espectroscópica multiparamétrica de etiquetas FRET nanoestructuradas, Nature Nanotechnology (2024). DOI:10.1038/s41565-024-01672-8
Información de la revista: Nanotecnología de la naturaleza
Proporcionado por la Universidad de Chicago
