"Lo que estamos haciendo aquí es visualizar la unión del pico a la ECA 2 [enzima convertidora de angiotensina 2], "dice Kirill Gorshkov, científico investigador del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NCATS) en Maryland, NOSOTROS.

Aunque esto pueda sonar inofensivo para los no iniciados, esta unión es el primer paso en un proceso de proliferación viral que puede haber conducido a la peor pandemia que se recuerde. El "pico" es una proteína del virus SARS-CoV-2 que es ampliamente reconocida como el arma principal de ataque para movilizar su ADN viral hacia una célula huésped. Los receptores ACE2 son proteínas de células humanas que abren efectivamente la puerta a este ataque. Usando puntos cuánticos de bioingeniería, Gorshkov y Eunkeu Oh en el Laboratorio de Investigación Naval (NRL) en Washington, CORRIENTE CONTINUA., y sus colegas pudieron obtener imágenes de la unión y posterior internalización que tiene lugar cuando ACE2 y la proteína de pico interactúan. "De hecho, puedes ver que eso sucede en tiempo real, "añade Gorshkov, "Esa es la belleza de este ensayo y por eso creemos que será importante para la detección de drogas".

Un virus no puede reproducirse sin registrar una célula huésped, por lo que investigadores de todo el mundo han estado trabajando para comprender cómo el SARS-CoV-2 interactúa y penetra en las células con el objetivo de bloquear esta etapa y prevenir la aparición de COVID19. Gorshkov y sus colegas en NCATS ya estaban trabajando en varios ensayos de imágenes para cánceres, virus y enfermedades de almacenamiento lisosómico, "pero cuando llega el coronavirus, rápidamente tuvimos que cambiar de marcha, "dice Gorshkov.

Investigaciones anteriores sobre el SARS habían destacado la importancia de las interacciones con ACE2 en las células humanas para la propagación de este tipo de virus. y ya pudieron marcar estas proteínas receptoras con una proteína verde fluorescente para visualizar sus movimientos. También se estaba acumulando evidencia para identificar las proteínas de pico específicas en el SARS-CoV-2 que podrían estar bloqueando a ACE2 en una fortaleza para que el virus pueda ingresar a la célula. Sin embargo, la información sobre las interacciones de las proteínas de punta se ha acumulado en su mayoría indirectamente a partir de ensayos bioquímicos o de proximidad y pruebas con proteínas y partes de proteínas extraídas del virus, las "pseudoviropartículas". Sin marcaje fluorescente de estas proteínas virales, su papel en la unión del receptor ACE2 y la subsiguiente internalización (endocitosis) continuó desempeñándose eficazmente al amparo de la oscuridad en las imágenes.

En NRL, Los investigadores también estaban interesados ​​en aprovechar su experiencia con nanopartículas para la entrega celular y la biosensibilidad para ayudar en los esfuerzos en la búsqueda de medicamentos anti-COVID19. Oh comenzó a buscar posibles formas de aplicar las técnicas de conjugación proteína-nanoestructura con las que había estado trabajando durante más de 15 años. Con dos proteínas que comparten una afinidad de unión (un punto cuántico unido a una y una nanopartícula fluorescente unida a la otra), la unión entre las dos proteínas acercará las nanoestructuras lo suficiente para la transferencia de energía entre ellas.

La extinción de la fluorescencia resultante permite a los investigadores controlar la unión de proteínas. "Si tiene algún inhibidor en el medio para detener la unión, esto se puede utilizar como un ensayo de inhibición para la detección de drogas, así que usamos mucho esto, "explica Oh. Al ver la posible aplicación para la detección de anticuerpos contra COVID19, Oh y su equipo dirigido por Mason Wolak presentaron sus ideas al equipo de NCATS, y las dos instituciones se pusieron manos a la obra para desarrollarlo aún más.

Desarrollando un "pseudovirion"

El primer paso del lado de la colaboración de Oh fue desarrollar un "pseudovirion" con las partes potentes de las proteínas de pico del SARS-CoV-2 (donde se encuentra el dominio de unión al receptor) unidas al punto cuántico de tal manera que las proteínas de pico continúan atacando y penetrando las células como un virus activo. Para esto, la orientación de las proteínas de la espiga y la forma del pseudovirion fue clave, y aquí, La amplia experiencia de Oh en conjugar proteínas activas con nanoestructuras dio sus frutos. Antes de pasar a las pruebas de entrega celular más caras, tuvieron que probar si su pseudovirion funcionaba fuera de las células conjugando nanopartículas de oro fluorescentes a los receptores ACE2 y monitoreando la extinción de la fluorescencia. Oh enumera las múltiples proporciones de proteína a punto cuántico, tamaños de puntos cuánticos y químicas de superficie que probaron antes de que finalmente pudieran observar la extinción de la fluorescencia en la unión a proteínas, y estaban listos para enviar el pseudovirion al equipo de Gorshkov "para hacer cosas interesantes con el celular real".

Para observar el pseudovirion interactuando con ACE2 en una célula real, el punto cuántico en el pseudovirion ahora necesitaba ser diseñado para emitir a una longitud de onda que fuera fácil de distinguir de la proteína verde fluorescente en ACE2, en lugar de optimizar la extinción de nanopartículas. Con las dos señales claras, el equipo de NCATS pudo rastrear la unión de las dos proteínas y la subsecuente endocitosis. Adicionalmente, pudieron ver que la unión y la endocitosis se prevenían en presencia de dos anticuerpos de prueba. Incluso podrían probar el mecanismo de endocitosis, que procede por medio de una proteína llamada dinamina. Cuando agregaron Dyngo-4a, que interrumpe dynamin, pudieron ver que se producía la unión, pero no una endocitosis posterior.

Los resultados también apuntan al éxito de las colaboraciones de investigación a distancia, ya que los equipos nunca se conocieron. "El tipo de colaboración que tenemos aquí es poco común, "dice Gorshkov, reflejando cuánto su progreso superó las colaboraciones anteriores donde había habido un mayor número de reuniones presenciales y actividades coordinadas. "Hubo tal impulso y tal enfoque de ambos grupos que realmente se sinergizó muy bien".

El pseudovirion de punto cuántico se limita a obtener imágenes de la penetración celular por endocitosis, y queda por determinar si este mecanismo entra en vigor para todos los tipos de células, tejido pulmonar en particular. Un mecanismo de ataque alternativo del SARS-CoV-2 se basa en la fusión de membranas, y obtener imágenes de esto con el pseudovirion de punto cuántico requeriría modificaciones significativas para interactuar con la célula más como una membrana. Sin embargo, el rápido rendimiento y las observaciones directas que permite el pseudovirion de punto cuántico deberían presentar ventajas significativas en la búsqueda de anticuerpos.

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