Los nudos son herramientas indispensables para actividades humanas como la navegación, pesca y escalada en roca, (por no mencionar, atarse los zapatos). Pero haciendo un nudo en una hebra de ADN en forma de cordón, midiendo solo mil millonésimas de metro de longitud, requiere paciencia y experiencia altamente especializada.

Hao Yan, un investigador en ASU, es una mano experta en este delicado y exótico campo, operando en la encrucijada de la nanotecnología y las bellas artes.

En una nueva investigación que aparece en la revista Comunicaciones de la naturaleza , Yan y sus colegas Fei Zhang, Xiaodong Qi y otros describen un método para convencer a segmentos de ADN monocatenario en estructuras complejas con nudos en 2 y 3-D.

Los resultados representan un avance importante en el acelerado campo de la nanotecnología del ADN, en el que la molécula de la vida se utiliza como material de construcción estructural para una amplia gama de configuraciones diminutas. Entre estos se encuentran minúsculos dispositivos robóticos, aplicaciones fotónicas, sistemas de administración de fármacos, puertas lógicas, así como aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

"Las estructuras de ADN anudadas demostradas en este trabajo exhiben una complejidad topológica sin precedentes, mucho más allá de lo que se ha logrado antes de utilizar el plegado de una sola hebra, "Yan dice." De hecho, No solo es asombroso, sino también sorprendente que el ADN y el ARN monocatenarios puedan pasar a través de sus propias cadenas y encontrar una manera de formar estructuras tan anudadas, dado el hecho de que una sola hebra tiene que pasar por tantos enredos ".

Yan dirige el Centro de Biodiseño para Diseño Molecular y Biomimética y es el Profesor Distinguido Martin D. Glick en la Facultad de Ciencias Moleculares de ASU.

Llevando el ADN al redil

El nuevo estudio involucra innovaciones en el campo del origami de ADN, cuales, como su nombre indica, utiliza ácidos nucleicos como el ADN y el ARN para plegarse y autoensamblarse en formas complejas. Esto ocurre cuando las bases de nucleótidos complementarios en el alfabeto de 4 letras del ADN entran en contacto y se unen, según un régimen estricto:las bases C siempre se emparejan con G y las bases A siempre se emparejan con T.

En naturaleza, cadenas de ácidos nucleicos proporcionan el código necesario para producir proteínas complejas. Esta biología básica proporciona la base de toda la vida terrestre. Aprovechando las propiedades simples de emparejamiento de bases del ADN, Es posible diseñar estructuras que se autoensamblen en el laboratorio. El método se ha aplicado tanto a formas de ADN monocatenarias como bicatenarias, dando lugar a nanoestructuras de complejidad y sofisticación cada vez mayores.

Si bien el origami de ADN ha logrado avances sorprendentes desde sus inicios, una innovación técnica ha sido tremendamente difícil de lograr. Hasta ahora, La creación de estructuras anudadas complejas en el ADN de una manera predecible y programable ha eludido a los investigadores.

El nuevo trabajo supera este obstáculo, establecer reglas de diseño precisas que permitan que los segmentos monocatenarios de ADN (o ARN) que van desde 1800-7500 nucleótidos formen nanoestructuras en forma de nudos con números de cruzamiento (donde la hebra de ADN se entrelaza dentro y fuera de su propia longitud) que van de 9 a 57 .

El grupo demostró además que estas nanoestructuras de ácidos nucleicos se pueden replicar y amplificar, tanto en condiciones de laboratorio como en sistemas vivos.

Nudos de la naturaleza

Estructuras anudadas, como los que Yan ha fabricado, (pero mucho más simples que los sintéticos), tienen correlatos en el mundo natural. Se han observado en el ADN y las proteínas y generalmente se forman durante la replicación y la transcripción. (cuando una secuencia de ADN se copia en ARN mensajero). También pueden aparecer en los genomas de los fagos, virus que infectan las células bacterianas.

Sin embargo, la construcción de nudos moleculares a escala nanométrica, mostrar geometrías bien definidas y consistentes requiere un enorme control y precisión. Como sucede, Los ácidos nucleicos como el ADN son ideales para el diseño y síntesis de tales nudos moleculares.

Previamente, Se han utilizado longitudes de ADN de doble hebra para construcciones a nanoescala, con la adición de piezas cortas o "hebras de fibra" para unir las estructuras resultantes. En cambio, el nuevo estudio utiliza una sola longitud de ADN diseñada para envolverse a sí misma de una manera precisa, secuencia de pasos preprogramada.

Una vez que las nanoestructuras de ADN anudadas se ensamblan con éxito, se obtienen imágenes mediante microscopía de fuerza atómica. Un cálculo cuidadoso permite a los investigadores optimizar las vías de plegado para producir el mayor rendimiento para cada estructura sintética. El uso de ADN monocatenario en lugar de bicatenario permite que las estructuras se produzcan en abundancia a un costo mucho menor.

Un enfoque monocatenario abre la puerta al diseño de nanoarquitecturas con funciones bien definidas, que se puede producir a través de sucesivas rondas de evolución in vitro, donde se seleccionan los atributos deseados en un proceso repetitivo de refinamiento. Más lejos, el enfoque descrito en el nuevo estudio proporciona una plataforma general para el diseño de estructuras moleculares de mayor tamaño y complejidad sin precedentes, allanando el camino para los avances en nanofotónica, entrega de medicamentos, análisis crio-EM y almacenamiento de memoria basado en ADN.

Diseñador de ADN (y ARN)

Para uno de los diseños de nudos iniciales, la estrategia que Yan y sus colegas desarrollaron consistió en enhebrar una sola hebra de ADN o ARN a través de sí misma 9 veces de acuerdo con una secuencia preprogramada. demostrando que el nuevo método es capaz de producir intrincadas formas geométricas que son programables, replicable y escalable.

La estrategia de diseño se amplió posteriormente para incluir estructuras de ARN monocatenario y nudos de ADN 3-D, cuyas formas fueron reconstruidas mediante una técnica conocida como microscopía electrónica de transmisión criogénica, confirmando su correcto plegado en las formas deseadas.

"Uno de los desafíos en este trabajo es cómo aumentar el rendimiento de ensamblaje de estructuras altamente anudadas". Dijo Fei. A diferencia de las nanoestructuras de ADN clásicas, los nudos de una sola hebra son menos tolerantes en términos de orden de plegado preciso debido a la complejidad topológica. Si un solo cruce se dobla mal durante el proceso, el error difícilmente se corregirá por sí mismo y la mayoría de los pliegues incorrectos permanecerán en la estructura completa. "Desarrollamos una estrategia de plegado jerárquica para guiar la formación correcta de nudos. Comparamos la eficiencia de plegado de un nudo con 23 cruces utilizando diferentes vías de plegado. Las imágenes AFM mostraron un aumento dramático en el rendimiento de plegado de estructuras bien formadas desde 0,9 % a 57,9% aplicando una ruta de plegado jerárquica optimizada ". Fei agregó.

Las reglas de diseño utilizadas para optimizar las vías de plegado se basan en el número de puntos de cruce, la longitud del ADN y el número de pares de bases en la estructura diseñada. Se establecieron tres reglas principales. Primero, Se encontró que las trayectorias de plegado lineales eran preferibles a las trayectorias ramificadas. Segundo, la sección desplegada de una hebra de ADN no debe pasar a través de sí misma en las primeras etapas cuando la hebra aún es larga. Finalmente, los bordes de la forma deseada que tienen tres cruces deben doblarse antes que los de dos cruces.

Siguiendo la estrategia de diseño, el equipo pudo crear nudos de ADN más complejos con un número creciente de cruces.

Las cadenas más largas de ADN monocatenario plantean desafíos únicos para el diseño de nanoestructuras programadas debido a la mayor probabilidad de autocomplementariedad involuntaria de las bases que componen la cadena. Una estructura de nudos de ADN que cuenta con 57 nodos cruzados ensamblados con éxito, aunque con menor rendimiento y menor precisión. Cuando el número de cruces se incrementó a 67, el rendimiento se redujo significativamente y las estructuras resultantes, fotografiado por AFM, mostró más errores de montaje.

El estudio informa los nudos de ADN más grandes hasta ahora ensamblados, formado por hasta 7.5k bases, con las topologías más complicadas, con hasta 57 regiones de cruce. Las secuencias de ADN monocatenario se pueden producir en masa en células vivas para una mayor eficiencia a menor costo. Por último, Pueden formarse nanoestructuras de ADN de diversas funciones dentro de las células, innovaciones a seguir en el trabajo futuro.