Los investigadores de la Escuela de Medicina de Harvard han mejorado el diseño de diminutos nanodiscos, modelos sintéticos de membranas celulares que se utilizan para estudiar proteínas que controlan lo que entra y sale de una célula. Las mejoras brindan una visión sin precedentes de cómo los virus infectan las células.

Los nuevos nanodiscos son más estables que las versiones anteriores y, por primera vez, se puede hacer en varios tamaños y formas precisas.

"Finalmente tenemos un entorno definido donde podemos estudiar cómo los virus u otras proteínas interactúan con las proteínas de la membrana y obtener detalles como nunca antes se habían visto". "dijo Gerhard Wagner, el Profesor Elkan Blout de Química Biológica y Farmacología Molecular en HMS y autor principal del estudio.

Las mejoras de diseño significan que los científicos ahora pueden observar bajo un microscopio como virus; en este caso, poliovirus:se acoplan a los nanodiscos, abren un poro e inyectan su material genético.

"Uno de los principales objetivos de la virología es comprender paso a paso cómo los virus ingresan a las células y hacer una 'película molecular, '", dijo el primer autor Mahmoud Nasr, becario de investigación en el laboratorio de Wagner. "La esperanza es que estos nanodiscos nos ayuden a recopilar más detalles sobre este proceso para que podamos diseñar vacunas y medicamentos de moléculas pequeñas para prohibir la entrada de virus".

Además, incrustar diferentes proteínas en los nanodiscos y hacerlas girar en espectrómetros de resonancia magnética nuclear (RMN) proporciona imágenes más nítidas de las estructuras y la dinámica de las proteínas de lo que era posible anteriormente, ayudando a los investigadores a comprender mejor las funciones de las proteínas en el cuerpo.

Los hallazgos se informaron en Métodos de la naturaleza el 21 de noviembre.

Abrocharse el cinturón

Los llamados nanodiscos de bicapa de fosfolípidos son básicamente haces de grasa ceñidos alrededor de la cintura por un par de cinturones de proteínas. Las grasas o lípidos, forman una doble capa como la de la membrana celular natural. Luego, los científicos pueden incrustar proteínas de membrana en la bicapa.

Los nanodiscos surgieron a principios de la década de 2000 como una alternativa a otros sustitutos de membrana que son demasiado grandes o inestables o que requieren detergentes. que interfieren con la dinámica de las proteínas naturales. Pero los nanodiscos presentaban sus propios problemas. Por ejemplo, los investigadores no pudieron hacerlos en tamaños consistentes, arrojando los resultados de la prueba.

El equipo de Wagner reconoció que el problema probablemente radicaba en el hecho de que los cinturones de proteínas que rodeaban los nanodiscos estaban abiertos, de modo que los discos se hincharon con cantidades desiguales de lípidos.

Bastante seguro, cuando los científicos hicieron una química elegante para abrochar los cinturones, los nanodiscos salieron en un rango de tamaño mucho más estrecho. Los discos también se mantuvieron mejor juntos con el tiempo y a las altas temperaturas necesarias para los experimentos de RMN.

Los investigadores encontraron que podían acortar o alargar los cinturones y aún así cerrarlos. permitiendo que los nanodiscos tengan un tamaño personalizado para adaptarse a proteínas de membrana específicas. Hasta aquí, han hecho discos con diámetros de 9, 11, 15 y 50 nanómetros.

Ser capaz de controlar el tamaño de los nanodiscos amplía la utilidad de las herramientas para una variedad de proteínas y tecnologías. La RMN requiere pequeños discos y proteínas, por ejemplo, mientras que la microscopía electrónica a menudo necesita grandes.

"No se pueden utilizar pequeños nanodiscos para estudiar enormes complejos de proteínas o para observar virus, que necesitan una superficie mínima para formar un poro, "dijo Nasr.

La mayoría de los nanodiscos son circulares, aunque los científicos también están jugando con una variedad de formas poligonales, de triángulos a hexágonos.

"Esperamos que al empaquetar juntos de manera más eficiente que los nanodiscos circulares, los nanodiscos poligonales, especialmente si podemos hacer pequeños, nos ayudará a cultivar buenos cristales, lo que nos proporciona otra forma de resolver las estructuras de las proteínas de membrana que incrustamos en ellas, "dijo Nasr.

Visor viral

Al final del pasillo del laboratorio de Wagner, James Hogle, el Profesor Edward S. Harkness de Química Biológica y Farmacología Molecular en HMS, y su becario postdoctoral Mike Strauss se encontraban con obstáculos tratando de aprender cómo los virus simples, como poliovirus, entrar en las celdas.

"Algo tiene que atravesar la membrana, "Dijo Hogle. Hubo alguna evidencia de que los poliovirus abrieron poros en la membrana y enviaron solo su material genético a través, pero los sistemas modelo que usaban los investigadores, llamados liposomas, eran demasiado irregulares e inestables para mostrar lo que estaba sucediendo en la membrana.

"No pudimos ver las partes que nos interesaban, "dijo Hogle.

Deseoso de averiguar si los nanodiscos modificados proporcionaban una mejor vista, Hogle y Strauss se unieron a Wagner y Nasr.

Primero, Nasr construyó discos de 50 nanómetros que eran lo suficientemente grandes como para contener todas las piezas del rompecabezas. Luego, el equipo incorporó proteínas en los nanodiscos que se unen a los poliovirus, añadió partículas de poliovirus a la mezcla, congeló las muestras y tomó instantáneas a través de un microscopio crioelectrónico.

"Le preguntamos al virus, Ven, adjunta al nanodisco, entra al celular y enséñanos lo que haces, '", Explicó Nasr.

Las imágenes mostraban algunas partículas de virus mordiendo el anzuelo, adhiriéndose a las proteínas receptoras, abriendo lo que parecían poros a través de la bicapa lipídica y liberando su ARN como si tratara de infectar una célula real.

"Nadie había visto un poro así antes, "dijo Nasr.

Los investigadores aún no han confirmado que los objetos que están viendo sean realmente poros, pero, Hogle dijo:"Sabemos que están ahí porque el ARN atraviesa".

"Seguro que parecen poros, ", agregó." Como dicen, 'Si camina como un pato, y grazna como un pato ... '"

Nasr ahora está tratando de hacer discos de 30 nanómetros aún mejor adaptados para ayudar al equipo de Hogle a determinar la estructura del complejo poliovirus / proteína receptora y profundizar en lo que está sucediendo en la membrana.

"Los nanodiscos son una técnica apasionante, "dijo Hogle." No puedo imaginar otra forma de ver cómo se ve el poro. Mahmoud fue muy inteligente para hacerlos funcionar y crear un sistema que abre la puerta a una amplia variedad de estudios ".

Los investigadores esperan que sus resultados iniciales alienten a otros a usar los nanodiscos para escudriñar muchas interacciones virus / receptor. Ya inundado de solicitudes de colaboración, El grupo de Wagner ha puesto a disposición una colección de cinturones de proteínas y está publicando un protocolo detallado para que otros laboratorios puedan construir los nanodiscos por su cuenta.

Detalle estructura

Más allá de estudiar la entrada viral, El equipo de Wagner demostró que los nanodiscos pueden mejorar los resultados de RMN y permitir que se estudien más proteínas de membrana mediante RMN. Estos incluyen receptores acoplados a proteína G, alrededor del 40 por ciento de los medicamentos actuales están diseñados para atacar.

"Con esta técnica, podemos obtener espectros fantásticos, "dijo Wagner.

Debido a que los nanodiscos no se descomponen a altas temperaturas, "podemos hacer experimentos de RMN durante semanas, y los GPCR no se degradan, "dijo Nasr.

Los nanodiscos también parecen estabilizar las proteínas incrustadas en ellos.

"Son muy resistentes a las enzimas que cortan las proteínas y las atacan, "Dijo Wagner.