El dispositivo CFM de sobremesa, que consta de la propia unidad CFM (en la parte superior), partes para transmitir la señal de la cámara, así como una batería (a la derecha), cabe en dos cubos estándar de una centrífuga de laboratorio común que se equilibran mediante contrapesos en los respectivos cubos opuestos. Crédito:Instituto Wyss de la Universidad de Harvard.
Desde la tensión de las fibras musculares en contracción hasta las tensiones hidrodinámicas dentro del flujo sanguíneo, Las moléculas dentro de nuestro cuerpo están sujetas a una amplia variedad de fuerzas mecánicas que influyen directamente en su forma y función. Al analizar las respuestas de moléculas individuales en condiciones en las que experimentan tales fuerzas, podemos desarrollar una mejor comprensión de muchos procesos biológicos, y potencialmente, Desarrollar fármacos de acción más precisa. Pero hasta ahora el análisis experimental de las interacciones de una sola molécula bajo la fuerza ha sido costoso, tedioso y difícil de realizar porque requiere el uso de equipos sofisticados, como un microscopio de fuerza atómica o pinzas ópticas, que solo permiten el análisis de una molécula a la vez.
Ahora, un equipo de investigación dirigido por Wesley Wong en el Instituto Wyss de Ingeniería Biológicamente Inspirada de Harvard y el Hospital Infantil de Boston ha logrado un gran avance al desarrollar un método económico que permite el análisis de las respuestas de fuerza de miles de moléculas similares simultáneamente. Ellos reportan en Comunicaciones de la naturaleza cómo los nanointerruptores de ADN programables se pueden usar en combinación con un microscopio de fuerza centrífuga (CFM) miniaturizado de nuevo diseño como una herramienta altamente confiable para observar miles de moléculas individuales y sus respuestas a las fuerzas mecánicas en paralelo.
"Este nuevo enfoque combinado nos permitirá a nosotros y a otros examinar cómo se comportan los complejos de una sola molécula cuando la fuerza sintonizable generada en nuestro CFM de nuevo diseño los saca de su equilibrio. Basando este instrumento en algo que la mayoría de los investigadores ya tienen y utilizan:la centrífuga de sobremesa:esperamos que las mediciones de fuerza de una sola molécula sean accesibles para casi todos, "dijo Wong, Doctor., quien es miembro del cuerpo docente asociado del Instituto Wyss y autor principal del estudio. También es profesor asistente en la Facultad de Medicina de Harvard en los Departamentos de Química Biológica y Farmacología Molecular y Pediatría. e Investigador del Programa de Medicina Celular y Molecular del Boston Children's Hospital.
La imagen en la parte superior muestra un nanointerruptor de ADN que forma una estructura en bucle cuando se forma un enlace entre los componentes reactivos adjuntos (por ejemplo, el par receptor-ligando se muestra en rojo y verde); en un extremo está unido a la plataforma de muestra y en el otro a una cuenta (parte superior). Aplicando fuerzas centrífugas al cordón en el dispositivo CFM, la unión entre los componentes reactivos puede romperse repetidamente, abriendo el bucle y aumentando la longitud de la correa de ADN (parte inferior), permitiendo mediciones altamente confiables de interacciones moleculares. En el CFM, muchas cuentas se pueden interrogar en paralelo, permitiendo mediciones de una sola molécula de alto rendimiento (abajo a la izquierda). En el video de la parte inferior derecha, la cámara captura estos eventos de ruptura en tiempo real al registrar el cordón en un lugar diferente. Crédito:Instituto Wyss de la Universidad de Harvard.
Los esfuerzos anteriores dirigidos por Wong en el Instituto Rowland de Harvard introdujeron el primer CFM en 2010, que era un instrumento altamente especializado que realizaba mediciones de fuerza de precisión de alto rendimiento en moléculas individuales atándolas a perlas y tirando de ellas mediante fuerza centrífuga. En su última versión de CFM, Wong y su equipo desarrollaron una forma de llevar a cabo la misma técnica con precisión similar utilizando un microscopio pequeño y económico hecho de elementos fáciles de ensamblar y piezas impresas en 3D que se pueden insertar en el cubo oscilante de una centrífuga de sobremesa estándar que se encuentra en prácticamente todos laboratorios de investigación biomédica.
Además, el equipo aumentó la solidez y precisión del ensayo al integrar miles de los llamados nanointerruptores de ADN, hebras de ADN lineal con pares de moléculas que interactúan que están asociadas con dos secuencias en el medio y que, además, al unirse entre sí, crean un bucle de ADN interno; Los extremos de los nanointerruptores están atados a la superficie de la muestra por un lado y a las perlas por el otro.
"Al aplicar un rango definido de fuerzas centrífugas a las perlas, podemos provocar la ruptura de los complejos moleculares que generan las estructuras de ADN en bucle que serán registradas por la lente acoplada a la cámara. Es importante destacar que, El uso de nanointerruptores de ADN como un andamio estable nos permite repetir este proceso varias veces con la misma molécula en condiciones de temperatura controlada, lo que mejora en gran medida nuestra precisión para determinar la heterogeneidad que puede mostrar una sola interacción molecular. "dijo Darren Yang, el primer autor del estudio y un estudiante de posgrado en el equipo de Wong.
En futuras investigaciones, Se pueden emplear nanointerruptores de ADN asociados a perlas para ensamblar y romper repetidamente muchos complejos biomoleculares diferentes y para definir las fuerzas mecánicas que los controlan. "Los nanointerruptores de ADN integrados son muy modulares, y se puede funcionalizar con muchas biomoléculas diferentes esencialmente de una manera plug-and-play, para permitir el estudio de una amplia variedad de interacciones moleculares con alto rendimiento y confiabilidad, "añadió Wong.
Próximo, Los científicos de Wyss planean aplicar su CFM en miniatura mejorado con nanointerruptores de ADN a la investigación de interacciones moleculares seleccionadas biomédicamente relevantes y dependientes de la fuerza, como las interacciones de proteínas que gobiernan la coagulación sanguínea o la audición.
"El equipo de Wong ha creado una nueva plataforma tecnológica que reduce en gran medida el costo del análisis de fuerza de una sola molécula y lo hace ampliamente accesible para la comunidad científica. Además de aumentar nuestra comprensión de las relaciones básicas entre la estructura y la función molecular, puede resultar una herramienta valiosa para el desarrollo de fármacos, "dijo el director fundador del Instituto Wyss, Donald Ingber, MARYLAND., Doctor., quien también es el profesor Judah Folkman de Biología Vascular en la Escuela de Medicina de Harvard y el programa de Biología Vascular en el Boston Children's Hospital, y Catedrático de Bioingeniería en SEAS.
