Un enfoque innovador para calibrar microscopios de alta tecnología permite a los investigadores rastrear el movimiento de moléculas individuales en 3D a nanoescala.
Un equipo de investigación de la Universidad de Stanford, dirigido por W. E. Moerner, amplía el trabajo que le valió a Moerner y sus colegas Eric Betzig y Stefan W. Hell el Premio Nobel de Química 2014. Betzig y Moerner fueron pioneros en el desarrollo de imágenes de superresolución, que rompió el límite de difracción de la microscopía óptica al utilizar la fluorescencia de moléculas individuales por primera vez. El nuevo trabajo publicado en la revista de alto impacto de The Optical Society Optica , demuestra una notable mejora en la precisión de esta técnica de imagen y para el seguimiento de moléculas en tres dimensiones.
Seguimiento de cómo se mueven las moléculas, formar formas e interactuar dentro de las células y neuronas del cuerpo ofrece una nueva y poderosa visión de los procesos biológicos clave, como la señalización, división celular y comunicación neuronal, todo lo cual tiene un impacto en la salud y la susceptibilidad a las enfermedades de las personas.
Aprovechando una transformación en microscopía
La microscopía de superresolución utiliza láseres para excitar la fluorescencia de moléculas individuales en condiciones en las que solo unas pocas emiten a la vez. superando el límite de resolución tradicional para microscopía óptica establecido por el límite de difracción de la luz.
"Con la llegada de las imágenes de superresolución, mejoramos la resolución en un factor de 5 a 10 más allá del límite de difracción, de 200 nanómetros a 40 o incluso 10 nanómetros, ", Dijo Moerner." Este nuevo mundo de resolución mucho mayor trae una gran transformación en cómo funciona el sistema óptico ".
Sin embargo, Las técnicas de calibración anteriores para microscopía de superresolución no eran lo suficientemente precisas para las mediciones 3D de moléculas individuales. El nuevo método de calibración utiliza una matriz de nanoagujeros para corregir las distorsiones ópticas en todo el campo de visión de un microscopio de campo amplio.
Lidiar con la distorsión
Al obtener imágenes a escala de moléculas individuales, un único punto de luz procedente de una molécula normalmente se puede localizar con una precisión de alrededor de 10 nanómetros. A resoluciones tan altas, cualquier pequeña imperfección en un sistema óptico introduce distorsiones en la imagen, o aberraciones, que puede sesgar significativamente las mediciones, particularmente en 3D. Los errores resultantes podrían significar la diferencia entre interpretar dos moléculas como interactuando o simplemente estar cerca una de la otra.
Si bien muchos usan perlas fluorescentes para calibrar microscopios 3D, Alex von Diezmann, candidato a doctorado en el Moerner Lab, Universidad Stanford, tomó un enfoque diferente. Creó una serie de agujeros en una película de metal, cada uno de menos de 200 nanómetros y con una separación regular de 2,5 micrones, para utilizar como estándar de calibración 3D. Una vez que los agujeros se llenaron con tintes fluorescentes, la matriz podría usarse para calibrar errores ópticos en todo el campo de visión del microscopio, no solo en algunos lugares seleccionados, como es posible usando perlas fluorescentes. Usando esta técnica, los investigadores pudieron corregir aberraciones de 50-100 nanómetros a solo 25 nanómetros.
"Anterior a eso, la gente no se había preocupado explícitamente por estas aberraciones, ", dijo von Diezmann." El hecho de que demostremos la presencia de aberraciones dependientes del campo, y demostró que podían degradar imágenes, es una parte importante de este trabajo ".
Los investigadores estudiaron la nueva técnica de calibración con funciones de dispersión de punto astigmático y de doble hélice, dos tipos de modificación óptica que se utilizan normalmente para extraer la ubicación del eje z. Aunque ambas funciones de dispersión de puntos mostraron inexactitudes relacionadas con el eje z que crearon un error de alrededor del 20 por ciento en las mediciones 3D, los investigadores corrigieron estas aberraciones utilizando la matriz de nanoagujeros 3D.
Demostrando beneficios para el estudio de proteínas en bacterias
Los investigadores ahora están aplicando la nueva técnica de calibración 3D a todos sus estudios de microscopía de superresolución y seguimiento de una sola molécula. Por ejemplo, von Diezmann lo está utilizando para estudiar la localización de proteínas en bacterias que miden solo dos micrones de longitud. Con la técnica de calibración 3D, Puede medir y rastrear con precisión proteínas de señalización clave en nanodominios que tienen un tamaño de solo 150 a 200 nanómetros.
Los investigadores señalan que corregir las aberraciones dependientes del campo y de otro tipo se está volviendo cada vez más importante a medida que las técnicas de microscopía óptica evolucionan para obtener imágenes más profundas en las células. por ejemplo.
"Estudiamos este enfoque en un par de casos, pero se puede utilizar con cualquier microscopía de superresolución o localización que requiera mediciones 3D realmente precisas, ", dijo von Diezmann." Será emocionante ver a otros grupos usarlo para descubrir cómo su técnica particular se ve afectada por aberraciones dependientes del campo. Como comunidad tal vez podamos encontrar formas aún mejores de lidiar con estas aberraciones ".
Los investigadores produjeron una herramienta de calibración 3D mediante la creación de una serie de agujeros a nanoescala llenos de tinte fluorescente. En un), La iluminación de campo amplio (verde) pasa a través del cubreobjetos de vidrio hacia un nanoagujero grabado en una capa de aluminio. La solución de tinte fluorescente llena los agujeros, y los puntos de luz resultantes (naranja) se detectan desde abajo. La figura (b) muestra una imagen de microscopio electrónico de barrido de los orificios, que tienen 200 nanómetros o menos de diámetro.
