La nanoscopia describe la capacidad de ver más allá del límite óptico generalmente aceptado de 200 a 300 nm. La microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED), desarrollada por Stefan W. Hell y Jan Wichmann en 1994, y demostrada experimentalmente por Hell y Thomas Klar en 1999, es una técnica de súper resolución para nanoscopía. La microscopía STED ha hecho un progreso considerable y se usa ampliamente en la investigación práctica. Pero su uso práctico implica cierto ruido de fondo no deseado, que afecta negativamente la resolución espacial y la calidad de la imagen. En general, este ruido proviene de dos fuentes de señal:(i) fluorescencia generada por la reexcitación causada por dosis de luz ultraaltas del haz de agotamiento; y (ii) fluorescencia residual, debido al agotamiento insuficiente del haz de inhibición.

En las últimas décadas se han desarrollado enfoques significativos de eliminación de fondo. Estos se pueden dividir en tres categorías:dominio del tiempo, dominio del espacio y dominio fasorial. Algunos de estos métodos son antiguos y otros se han desarrollado más recientemente. Si bien son formas poderosas de eliminar el ruido no deseado de las imágenes de microscopía STED, todas conllevan inconvenientes, incluida la distorsión de la imagen, tiempos de adquisición prolongados o la introducción de ruido de disparo. La microscopía STED aún tiene que alcanzar todo su potencial.

Como se informó en Advanced Photonics , investigadores de la Universidad de Zhejiang desarrollaron recientemente un método novedoso llamado STED de "diferencia de modulación dual" (dmdSTED) para suprimir los fondos de manera selectiva y efectiva. El método funciona clasificando las señales del dominio espacial en el dominio de la frecuencia para que la fluorescencia no reducida y el fondo inducido por STED se separen convenientemente de las señales fluorescentes deseadas. Los haces de excitación y agotamiento se cargan respectivamente con diferentes modulaciones en el dominio del tiempo. Dado que evita la reexcitación causada por el haz de agotamiento, se puede seleccionar un láser de agotamiento con una longitud de onda más cercana al pico del espectro de emisión de fluorescencia de la muestra, reduciendo así la intensidad de agotamiento requerida.

La versión actual de dmdSTED funciona con una resolución espacial de λ/8, una resolución más alta que la de los métodos de dominio fasorial (p. ej., SPLIT, λ/5) que son propensos al ruido de disparo. Teóricamente, este enfoque puede evitar la posible pérdida de señal por enfoques en el dominio del tiempo (como el control del tiempo). Además, dmdSTED es compatible con escenarios de onda pulsada o continua, y no se requiere hardware para el conteo de fotones individuales correlacionados con el tiempo (TCSPC). En comparación con los métodos de dominio espacial, la resolución temporal de dmdSTED no está limitada. Por lo tanto, dmdSTED es ventajoso en la adquisición de imágenes de microscopía fina integrales, en resolución espacial, SNR y resolución de tiempo.

Según el autor principal Xu Liu, director del Laboratorio Estatal Clave de Instrumentación Óptica Moderna, "este método de dominio de frecuencia posee un gran potencial para integrarse en otras técnicas de escaneo de puntos de doble haz, como microscopía de saturación de estado excitado (ESSat), estado de carga microscopía de agotamiento (CSD), microscopía de agotamiento del estado fundamental (GSD), etc.. Además, puede aceptar más tipos de muestras con características espectrales diferentes de los tintes fluorescentes comúnmente utilizados en STED, como algunos puntos cuánticos con un espectro de excitación más amplio. " + Explora más

Supresión de fondo para microscopía óptica de súper resolución