El láser de baja tasa de repetición excita múltiples señales de fluorescencia. Crédito:Cortesía de T. Qiao (HKU).
La microscopía de dos fotones (2PM) desempeña un papel confiablemente eficiente en la obtención de imágenes no invasivas de tejido profundo en la investigación biomédica. Desde la invención del microscopio de dos fotones a fines del siglo XX, ha habido un flujo constante de investigaciones relacionadas con el avance de 2PM, desde fluoróforos hasta métodos y aplicaciones de imágenes, en los campos de la bioquímica y la medicina.
Cómo obtener imágenes de tejidos más profundos ha sido un gran desafío en la obtención de imágenes de dos fotones. Las fuentes láser pueden abordar potencialmente ese desafío. Sin embargo, el láser de bloqueo de modo Ti:zafiro tradicional para imágenes de dos fotones está limitado por su alta frecuencia de repetición y no puede proporcionar la alta energía de pulso necesaria para imágenes de tejido profundo con baja potencia de exposición. El láser de fibra supera la alta tasa de repetición convenientemente agregando unas pocas docenas de metros de fibras en la cavidad, pero en algunos casos adolece de bajas ganancias y baja relación señal-ruido (SNR).
Recientemente, como se informó en Advanced Photonics Nexus , investigadores del Grupo Omega de Kenneth Wong en la Universidad de Hong Kong (HKU) desarrollaron un láser de alto rendimiento como un nuevo tipo de fuente de luz para la microscopía multifotónica. Informaron sobre un láser de 937 nm, con la frecuencia duplicada de un láser bloqueado en modo de fibra a 1,8 μm, con una tasa de repetición baja de ~9 MHz y una SNR alta de 74 dB.
La novedosa fuente láser de 937 nm se basa en la modulación de fase propia en la fibra monomodo para aumentar simultáneamente la potencia de 1,8 μm y comprimir el ancho del pulso. El diseño del láser de 937 nm es adecuado para obtener imágenes de tejidos profundos de alta sensibilidad de múltiples proteínas de fluorescencia. La fuente de luz láser proporciona excitaciones de dos fotones en múltiples tipos de tejidos biológicos. La profundidad de penetración demostrada con el cerebro de un ratón alcanzó los 620 μm, lo que revela la capacidad de esta técnica para obtener imágenes de tejidos profundos. Los investigadores también realizaron imágenes de generación de segundo armónico (SHG), demostrando imágenes sin etiquetas y validando inicialmente el potencial de esta fuente de luz para aplicaciones de imágenes multimodales.
Resultados de imágenes de dos fotones, basados en el novedoso láser de 937 nm. ( a ) y ( b ) Imágenes de fluorescencia de dos fotones de neuronas y fibras marcadas con YFP en una rebanada de cerebro de ratón. ( c ) Dos imágenes de fluorescencia de fotones de las vasculaturas teñidas con trazador lipofílico a diferentes profundidades del cerebro del ratón. ( d ) Reconstrucción 3D de las imágenes de neuronas cerebrales de ratón marcadas con EGFP. Crédito:Él, Tang y otros, doi 10.1117/1.APN.1.2.026001.
Thanks to its low repetition frequency and high signal-to-noise ratio, the light source requires only 10 mW of power to image tissue at depths of over 600 µm, significantly lower than the 40-MHz fiber laser, which requires approximately 200-mW power at a similar depth. This greatly reduces photobleaching and photodamage in imaging, improving the depth of tissue imaging and safety in live (in vivo) imaging.
This work will facilitate greater insights into deep tissue imaging for research and biomedical applications. Postdoctoral fellow at HKU and corresponding author Tian Qiao remarks that "this novel high-SNR 937-nm laser source achieves a good balance between sensitivity, penetration depth, and imaging speed for two-photon imaging. Its great performance in two-photon imaging indicates its exciting potential for biological investigations, such as in vivo deep-tissue imaging and multimode imaging." High-power hybrid laser emitter penetrates deeper into skin to enhance disease diagnosis
