Un grupo de investigación dirigido por Takashi Saito, de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ehime, desarrolló un microscopio de fluorescencia de hoja de luz de excitación de 2 fotones que (1) reduce la fototoxicidad, (2) amplía el campo de visión, y (3) aumenta la resolución espacial. Este microscopio, cuando se utiliza para la observación de peces medaka, hizo posible observar todo el cuerpo del embrión (un campo de visión extendido) con una resolución a nivel celular (alta resolución espacial) sin afectar el crecimiento de los peces (baja fototoxicidad) durante un lapso de tres días de desarrollo embrionario. Este resultado fue publicado en la revista científica Comunicaciones de la naturaleza .

El microscopio de fluorescencia se utiliza ampliamente en el campo de las ciencias de la vida para observar moléculas dentro de una célula de forma no invasiva. La microscopía de fluorescencia de hoja de luz permite grabar imágenes tridimensionales con alta velocidad de adquisición y alta resolución espacial. Sin embargo, en microscopios de hoja de luz convencionales, es difícil limitar el fotodaño a los tejidos vivos, y también es difícil lograr simultáneamente un campo de visión amplio y una resolución espacial alta (nivel de celda).

Desarrollo de un campo amplio de excitación de dos fotones, microscopio de hoja de luz

El grupo de investigación de la Universidad Ehime de Takashi Saitou, Sota Takanezawa, y Takeshi Imamura utilizó el fenómeno de excitación de dos fotones como clave para resolver este problema. El microscopio de excitación de dos fotones con láseres infrarrojos permite obtener imágenes suaves (poco fototóxicas) de los organismos vivos. Sin embargo, debido a que la luz debe enfocarse en un rango estrecho para inducir la excitación de dos fotones, el rango de excitación (en microscopio de hoja de luz, el campo de visión) es estrecho. Para solucionar esto, los investigadores desarrollaron una unidad óptica de iluminación simple con un haz de Bessel que expande el rango de propagación del láser en la dirección del eje óptico (Fig. 1A). Esta unidad puede estirar la longitud del haz a 600-1000 μm mientras mantiene una resolución axial de 2-3 μm cuando se usa una lente de objetivo NA0.3 con aumento de 10x. Usando esta unidad óptica, construyeron una microscopía de hoja de luz de excitación de dos fotones (Fig. 1B), lo que permite realizar imágenes de cuerpo entero de larvas de medaka con resolución celular (Fig. 1C).

La medaka se utiliza ampliamente como organismo modelo para vertebrados. Es adecuado para imágenes fluorescentes ya que es pequeño y transparente. Para evaluar la aplicabilidad del microscopio para su uso en organismos vivos, los investigadores realizaron una evaluación de fototoxicidad. Esto reveló un fotodaño reducido en comparación con el microscopio de hoja de hoja de luz de haz gaussiano convencional. Por lo tanto, se sugiere que sea adecuado para imágenes en vivo a largo plazo. Luego, los investigadores aplicaron imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de la medaka transgénica en la que el endotelio linfático está marcado con proteína verde fluorescente. y logró obtener imágenes en vivo durante tres días a intervalos de cinco minutos (Fig. 2).

En este estudio, los investigadores desarrollaron un nuevo microscopio de fluorescencia de hoja de luz de alto rendimiento. Usando esta tecnología, Los científicos pueden observar casi todos los procesos de crecimiento embrionario del pez medaka con alta resolución celular en todo el cuerpo del pez. Se espera que esta tecnología contribuya a la comprensión a nivel molecular del desarrollo embrionario, la elucidación de la patogenia de las enfermedades relacionadas con el estilo de vida, y promover la tecnología del desarrollo de medicamentos.