La microscopía de fluorescencia se usa ampliamente en bioquímica y ciencias de la vida porque permite a los científicos observar directamente las células y ciertos compuestos dentro y alrededor de ellas. Las moléculas fluorescentes absorben la luz dentro de un rango de longitud de onda específico y luego la reemiten en el rango de longitud de onda más largo. Sin embargo, la principal limitación de las técnicas convencionales de microscopía de fluorescencia es que los resultados son muy difíciles de evaluar cuantitativamente; La intensidad de la fluorescencia se ve significativamente afectada tanto por las condiciones experimentales como por la concentración de la sustancia fluorescente. Ahora, Un nuevo estudio realizado por científicos de Japón revolucionará el campo de la microscopía de fluorescencia de por vida.

Una forma de solucionar el problema convencional es centrarse en la vida útil de la fluorescencia en lugar de en la intensidad. Cuando se irradia una sustancia fluorescente con un breve estallido de luz, la fluorescencia resultante no desaparece inmediatamente, sino que en realidad "decae" con el tiempo de una manera que es específica para esa sustancia. La técnica de microscopía de fluorescencia de por vida aprovecha este fenómeno, que es independiente de las condiciones experimentales, cuantificar moléculas fluorescentes y cambios en su entorno. Sin embargo, el decaimiento de la fluorescencia es extremadamente rápido, y las cámaras normales no pueden capturarlo. Si bien se puede usar un fotodetector de un solo punto, debe escanearse en toda el área de la muestra para poder reconstruir una imagen bidimensional completa a partir de cada punto medido. Este proceso implica el movimiento de piezas mecánicas, lo que limita en gran medida la velocidad de captura de imágenes.

En este estudio reciente, publicado en Avances de la ciencia , el equipo de científicos desarrolló un enfoque novedoso para adquirir imágenes de fluorescencia de por vida sin la necesidad de un escaneo mecánico. Profesor Takeshi Yasui, del Instituto de Fotónica Post-LED (pLED), Universidad de Tokushima, Japón, quien dirigió el estudio, dice, "Nuestro método puede interpretarse como un mapeo simultáneo 44, 400 'cronómetros' basados ​​en luz en un espacio 2-D para medir la vida útil de la fluorescencia, todo en una sola toma y sin escaneo ".

Uno de los pilares principales de su método es el uso de un peine de frecuencia óptica como luz de excitación de la muestra. Un peine de frecuencia óptica es esencialmente una señal de luz compuesta por la suma de muchas frecuencias ópticas discretas con un espaciado constante entre ellas. La palabra "peine" en este contexto se refiere a cómo se ve la señal cuando se traza contra la frecuencia óptica:un grupo denso de picos equidistantes que se elevan desde el eje de frecuencia óptica y se asemejan a un peine. Usando equipo óptico especial, un par de señales de peine de frecuencia de excitación se descomponen en señales de latido óptico individuales (latidos ópticos de doble peine) con diferentes frecuencias de modulación de intensidad, cada uno con una sola frecuencia de modulación e irradiado sobre la muestra objetivo. La clave aquí es que cada haz de luz incide en la muestra en una ubicación espacialmente distinta, creando una correspondencia uno a uno entre cada punto de la superficie 2-D de la muestra (píxel) y cada frecuencia de modulación de los latidos ópticos de doble peine.

Debido a sus propiedades de fluorescencia, la muestra vuelve a emitir parte de la radiación capturada al tiempo que conserva la correspondencia entre la frecuencia y la posición. Luego, la fluorescencia emitida por la muestra se enfoca simplemente usando una lente en un fotodetector de un solo punto de alta velocidad. Finalmente, la señal medida se transforma matemáticamente en el dominio de la frecuencia, y la vida útil de la fluorescencia en cada "píxel" se calcula fácilmente a partir del retardo de fase relativo que existe entre la señal de excitación a esa frecuencia de modulación frente a la medida.

Gracias a su velocidad superior y alta resolución espacial, El método de microscopía desarrollado en este estudio facilitará el aprovechamiento de las ventajas de las mediciones de la vida útil de la fluorescencia. "Debido a que nuestra técnica no requiere escaneo, se garantiza una medición simultánea de toda la muestra en cada disparo, "dice el profesor Yasui, "Esto será útil en las ciencias de la vida donde se necesitan observaciones dinámicas de células vivas". Además de proporcionar una visión más profunda de los procesos biológicos, este nuevo enfoque podría usarse para obtener imágenes simultáneas de múltiples muestras para la prueba de antígenos, que ya se está utilizando para el diagnóstico de COVID-19.

Quizás lo más importante este estudio muestra cómo la frecuencia óptica se combina, que solo se utilizaban como "reglas de frecuencia, "puede encontrar un lugar en las técnicas de microscopía para ampliar los límites de las ciencias de la vida. Es prometedor para el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas para tratar enfermedades intratables y mejorar la esperanza de vida, beneficiando así a toda la humanidad.