Un gran esfuerzo de colaboración que se ha estado desarrollando durante los últimos tres años entre ASU y científicos europeos, ha dado lugar a un avance técnico significativo en las estrategias de muestras cristalográficas de rayos X.

La contribución de la ASU proviene de la Facultad de Ciencias Moleculares (SMS), Departamento de Física y el Centro de Biodesign Institute Center for Applied Structural Discovery.

El láser europeo de electrones libres de rayos X (EuXFEL) es una instalación de investigación de superlativos:genera pulsos de rayos X ultracortos — 27, 000 veces por segundo y con un brillo mil millones de veces superior al de las mejores fuentes de radiación de rayos X convencionales. Después de diez años de construcción, abrió para experimentos iniciales a finales de 2017. El grupo de Alexandra Ros, El profesor de SMS de ASU recibió la segunda asignación de tiempo de haz entre los competidores mundiales.

Sus resultados, publicado el 9 de septiembre en Comunicaciones de la naturaleza , validó un generador de gotas de microfluidos único para reducir el tamaño de la muestra y el desperdicio (que puede llegar al 99 por ciento) en los experimentos de Cristalografía de Femtosegundos en Serie (SFX) de su equipo. Usando esto, determinaron la estructura cristalina de la enzima 3-desoxi-d-mano-octulosonato 8-fosfato sintasa (KDO8PS) y revelaron nuevos detalles en una región de bucle previamente indefinida de la enzima que es un objetivo potencial para estudios de antibióticos.

"Estamos emocionados de que este trabajo, resultado de un gran esfuerzo de colaboración, ha sido bien recibido en la comunidad XFEL, ", explicó Ros." Estamos desarrollando más este método y estamos buscando la sincronización de las gotas de microfluidos con los pulsos de XFEL. En este preciso momento, un pequeño equipo de estudiantes de ASU acaba de terminar de realizar experimentos en la fuente de luz coherente Linac (LCLS) en el Laboratorio del Acelerador Nacional SLAC en Menlo Park, CA para refinar el método. No podría haber habido un mejor momento para la publicación de nuestro trabajo ".

SLAC ha sido la instalación de XFEL más conocida por los científicos estadounidenses donde se llevó a cabo el ahora famoso trabajo sobre cristalografía de nanocristales de proteínas (por el equipo de ASU dirigido por los profesores John Spence y Petra Fromme). SLAC y su compañera en Europa, también en Hamburgo, han tenido mucho éxito y, en consecuencia, se han vuelto muy overbooking. La puesta en línea de la nueva instalación, con su túnel acelerador gigante de 2.6 millas y resolución de escala de longitud atómica, ha aliviado parte de la demanda en las otras instalaciones, al tiempo que ofrece grandes nuevas posibilidades en las ciencias físicas.

SFX es una técnica prometedora para la determinación de la estructura de proteínas, donde una corriente líquida que contiene cristales de proteínas se cruza con un haz XFEL de alta intensidad que es mil millones de veces más brillante que las fuentes tradicionales de rayos X de sincrotrón.

Aunque los cristales son destruidos por el intenso haz XFEL inmediatamente después de que se han difractado, la información de difracción puede, notablemente, aún se grabará gracias a los detectores de última generación. Se han desarrollado nuevos y poderosos métodos de análisis de datos, permitiendo a un equipo analizar estos patrones de difracción y obtener mapas de densidad de electrones e información estructural detallada de proteínas.

El método es especialmente atractivo para proteínas difíciles de cristalizar, como las proteínas de membrana, ya que produce información estructural de alta resolución a partir de microcristales e incluso nanocristales, reduciendo así la contribución de los defectos cristalinos y evitando el tedioso (si no imposible) crecimiento de los grandes cristales que demanda la cristalografía tradicional basada en sincrotrón.

Si bien la cristalografía con XFEL ha sido una técnica poderosa para desentrañar las estructuras de grandes complejos de proteínas y también permitir la cristalografía resuelta en el tiempo, esta ciencia de vanguardia, sin embargo, engendra un problema importante. Debido a la pequeña tasa de "aciertos", requiere grandes cantidades de proteína en suspensión, que aunque no irradiado, son engorrosos de recuperar para la mayoría de las muestras de proteínas. Se puede desperdiciar hasta el 99% de la proteína.

Aquí radica el gran avance técnico realizado por Ros y su equipo. Han desarrollado un dispositivo de microfluidos impreso en 3-D, que es de alta resolución, y genera gotas de agua en aceite de segmentación variable de gotas que pueden sincronizarse con los pulsos de láser de electrones libres. Esto reduce drásticamente la cantidad de proteína purificada necesaria para el experimento europeo XFEL del requerimiento de 1 g actualmente típico (y casi inaccesible) para el registro del conjunto de datos completo.

Vale la pena reafirmar la importancia de este desarrollo. El enfoque de los investigadores intercala "babosas" líquidas cargadas de muestra dentro de un líquido de sacrificio, de modo que se mantiene un microchorro de líquido de rápido movimiento con la muestra presente solo durante la exposición a los pulsos XFEL de femtosegundos (una millonésima de una mil millonésima de segundo de duración).

El equipo de científicos ha demostrado la generación de gotas de las suspensiones de cristal de la enzima KDO8PS con el generador de gotas de microfluidos y ha demostrado que la frecuencia de generación de gotas se puede controlar mediante las velocidades de las corrientes acuosa y de aceite. La calidad de difracción de los cristales de KDO8PS es similar tanto cuando se inyectan en gotitas acuosas rodeadas de aceite como por inyección continua con una Boquilla Virtual Dinámica de Gas (GDVN), con una reducción de ~ 60% en el consumo de muestra logrado con la inyección de gotas.

La estructura determinada reveló nuevos detalles en una región de bucle previamente indefinida de KDO8PS, un objetivo potencial para los estudios de antibióticos. Estos resultados abogan por la futura integración rutinaria de la generación de gotas mediante el flujo de aceite segmentado en otros XFEL de todo el mundo.