La capacidad de transformar la luz solar en energía es una de las hazañas más notables de la naturaleza. Los científicos comprenden el proceso básico de la fotosíntesis, pero muchos detalles cruciales siguen siendo esquivos, que ocurren en dimensiones y escalas de tiempo fugaces que durante mucho tiempo se consideraron demasiado minúsculas para sondear.

Ahora, eso está cambiando.

En un nuevo estudio, dirigido por Petra Fromme y Nadia Zatsepin en el Biodesign Center for Applied Structural Discovery, la Facultad de Ciencias Moleculares y el Departamento de Física de ASU, Los investigadores investigaron la estructura del fotosistema I (PSI) con pulsos de rayos X ultracortos en el láser europeo de electrones libres de rayos X (EuXFEL), ubicado en Hamburgo, Alemania.

PSI es un gran sistema biomolecular que actúa como un convertidor de energía solar que transforma la energía solar en energía química. La fotosíntesis proporciona energía para toda la vida compleja en la Tierra y suministra el oxígeno que respiramos. Los avances para desentrañar los secretos de la fotosíntesis prometen mejorar la agricultura y ayudar en el desarrollo de sistemas de almacenamiento de energía solar de próxima generación que combinan la eficiencia de la naturaleza con la estabilidad de los sistemas diseñados por humanos.

"Este trabajo es tan importante, como muestra la primera prueba de concepto de cristalografía en serie de megahercios con una de las proteínas de membrana más grandes y complejas en la fotosíntesis:el fotosistema I ", dice Fromme." El trabajo allana el camino hacia estudios de resolución temporal en el EuXFEL para determinar películas moleculares de la ruta impulsada por la luz de los electrones en la fotosíntesis o visualice cómo los medicamentos contra el cáncer atacan las proteínas que funcionan mal ".

El EuXFEL, que recientemente comenzó a operar, es el primero en emplear un acelerador lineal superconductor que ofrece nuevas y emocionantes capacidades que incluyen tasas de repetición de megahercios muy rápidas de sus pulsos de rayos X, más de 9000 veces más rápido que cualquier otro XFEL, con pulsos separados por menos de una millonésima de segundo. Con estas increíblemente breves ráfagas de luz de rayos X, los investigadores podrán grabar películas moleculares de procesos biológicos fundamentales mucho más rápidamente y probablemente impactarán en diversos campos, como la medicina y la farmacología, química, física, ciencia de los Materiales, investigación energética, Estudios ambientales, electrónica, nanotecnología, y fotónica. Petra Fromme y Nadia Zatsepin son coautores correspondientes del artículo, publicado en el número actual de la revista Comunicaciones de la naturaleza .

Fuerza en números

Fromme es el director del Biodesign Center for Applied Structural Discovery (CASD) y lidera los esfuerzos del equipo experimental del proyecto, mientras que Zatsepin dirigió el equipo de análisis de datos de XFEL.

"Este es un hito importante en el desarrollo de la cristalografía en serie de femtosegundos, sobre la base del esfuerzo bien coordinado de un gran interdisciplinario, equipo internacional y años de desarrollo en campos dispares "enfatiza Zatsepin, ex profesor asistente de investigación en el Departamento de Física y Biodiseño CASD de ASU, y ahora investigador principal de la Universidad La Trobe en Australia.

Christopher Gisriel, el co-primer autor del artículo, trabajó en el proyecto mientras era investigador postdoctoral en el laboratorio Fromme y está entusiasmado con el proyecto. "La recopilación rápida de datos en experimentos de cristalografía de femtosegundos en serie hace que esta técnica revolucionaria sea más accesible para aquellos interesados ​​en la relación estructura-función de las enzimas. Esto se ejemplifica en nuestra nueva publicación en Comunicaciones de la naturaleza mostrando que incluso las estructuras de proteínas más difíciles y complejas pueden resolverse mediante cristalografía en serie de femtosegundos mientras se recopilan datos a una tasa de repetición de megahercios ".

"Es muy emocionante ver el arduo trabajo de las muchas personas que impulsaron la materialización de este proyecto, "dice Jesse Coe, co-primer autor que se graduó el año pasado con un Ph.D. en Bioquímica de ASU. "Este es un gran paso en la dirección correcta hacia una mejor comprensión del proceso de transferencia de electrones de la naturaleza, que se ha perfeccionado durante miles de millones de años".

Ciencia extrema

Un XFEL (para láser de rayos X de electrones libres) emite una luz de rayos X que es mil millones de veces más brillante que las fuentes de rayos X convencionales. El brillante, Los pulsos de rayos X similares a los de un láser son producidos por electrones acelerados hasta casi la velocidad de la luz y alimentados a través del espacio entre series de imanes alternos, un dispositivo conocido como ondulador. El ondulador obliga a los electrones a agitarse y agruparse en paquetes discretos. Cada uno de los racimos de electrones ondulantes perfectamente sincronizados emite una poderosa breve pulso de rayos X a lo largo de la trayectoria de vuelo del electrón.

En cristalografía de femtosegundos en serie, se inyecta un chorro de cristales de proteína en la trayectoria del haz pulsado XFEL a temperatura ambiente, produciendo información estructural en forma de patrones de difracción. De estos patrones, los científicos pueden determinar imágenes a escala atómica de proteínas en condiciones cercanas a las nativas, allanando el camino hacia películas moleculares precisas de moléculas en funcionamiento.

Los rayos X dañan las biomoléculas, un problema que ha plagado los esfuerzos de determinación de estructuras durante décadas, requiriendo que las biomoléculas se congelen para limitar el daño. Pero las ráfagas de rayos X producidas por un XFEL son tan breves (apenas duran femtosegundos) que la dispersión de rayos X de una molécula se puede registrar antes de que se produzca la destrucción. similar a usar un obturador de cámara rápido. Como punto de referencia, un femtosegundo es una millonésima de mil millonésima de segundo, la misma proporción que un segundo es 32 millones de años.

Debido a la sofisticación, tamaño y costo de las instalaciones de XFEL, Actualmente, solo cinco están disponibles para tales experimentos en todo el mundo, un grave cuello de botella para los investigadores, ya que cada XFEL normalmente solo puede albergar un experimento a la vez. La mayoría de los XFEL generan pulsos de rayos X entre 30 y 120 veces por segundo y puede llevar varias horas o días recopilar los datos necesarios para determinar una sola estructura. y mucho menos una serie de fotogramas en una película molecular. El EuXFEL es el primero en emplear un acelerador lineal superconductor en su diseño, permitiendo la sucesión más rápida de pulsos de rayos X de cualquier XFEL, lo que puede reducir significativamente el tiempo necesario para determinar cada estructura o fotograma de la película.

Alto riesgo, alta recompensa

Debido a que la muestra es borrada por los intensos pulsos de rayos X, debe reponerse a tiempo para el siguiente pulso de rayos X, que requería que los cristales de PSI se entregaran 9000 veces más rápido en el EuXFEL que en los XFEL anteriores, a una velocidad de chorro de aproximadamente 50 metros por segundo (160 pies por segundo), como una manguera de microfluidos contra incendios. Esto fue un desafío ya que requiere grandes cantidades de la preciosa proteína contenida en cristales uniformes para alcanzar estas altas velocidades de chorro y evitar bloquear el sistema de entrega de muestras. Las proteínas de membrana grandes son tan difíciles de aislar, cristalizar y entregar a la viga, que no se sabía si esta importante clase de proteínas podría estudiarse en EuXFEL.

El equipo desarrolló nuevos métodos que permitieron PSI, que es un gran complejo que consta de 36 proteínas y 381 cofactores, que incluyen las 288 clorofilas (los pigmentos verdes que absorben la luz) y tiene más de 150, 000 átomos y es más de 20 veces más grande que las proteínas anteriores estudiadas en EuXFEL, determinar su estructura a temperatura ambiente con una notable resolución de 2,9 angstrom, un hito importante.

Miles de millones de microcristales de la proteína de membrana PSI, derivado de cianobacterias, tenía que cultivarse para el nuevo estudio. Se requirió un rápido crecimiento de cristales a partir de semillas de nanocristales para garantizar la uniformidad esencial del tamaño y la forma de los cristales. PSI es una proteína de membrana, que es una clase de proteínas de gran importancia que han sido notoriamente difíciles de caracterizar. Sus elaboradas estructuras están incrustadas en la bicapa lipídica de la membrana celular. Típicamente, deben aislarse cuidadosamente en forma completamente activa de su entorno nativo y transformarse en un estado cristalino, donde las moléculas se empaquetan en cristales pero mantienen toda su función nativa.

En el caso de PSI, esto se logra extrayéndola con detergentes muy suaves que reemplazan la membrana y rodean la proteína como un tubo interior de piscina, que imita el entorno de la membrana nativa y mantiene la PSI completamente funcional una vez que se empaqueta dentro de los cristales. Entonces, cuando los investigadores iluminan los pigmentos verdes (clorofilas) que captan la luz por el sistema de antena de PSI, la energía se utiliza para disparar un electrón a través de la membrana.

Para mantener PSI completamente funcional, los cristales solo están empaquetados débilmente y contienen un 78% de agua, lo que los ablanda como un trozo de mantequilla al sol y dificulta el manejo de estos frágiles cristales. "Aislar, caracterizar y cristalizar un gramo de PSI, o mil millones de mil millones de moléculas de PSI, porque los experimentos en su forma totalmente activa fue un gran esfuerzo de los estudiantes e investigadores de mi equipo ", dice Fromme". En el futuro, con tasas de repetición aún más altas y nuevos sistemas de entrega de muestras, el consumo de muestras se reducirá drásticamente ".

El registro y análisis de los datos de difracción fue otro desafío. EuXFEL y DESY desarrollaron un detector de rayos X único para manejar las demandas de los estudios de biología estructural en EuXFEL:el detector de píxeles integrador de ganancia adaptativa, o AGIPD. Cada uno de los 1 millón de píxeles de AGIPD tiene menos de una centésima de pulgada de ancho y contiene 352 celdas de memoria analógicas, que permiten a la AGIPD recopilar datos a velocidades de megahercios en un amplio rango dinámico. Sin embargo, Para recopilar datos cristalográficos precisos de microcristales de proteínas de membrana grandes se requería un compromiso entre la resolución espacial y el muestreo de los datos.

"Presionar para obtener una recopilación de datos de mayor resolución con el tamaño actual del detector podría impedir el procesamiento útil de los datos cristalográficos porque los puntos de difracción no se resuelven lo suficiente con los píxeles del detector de rayos X", advierte Zatsepin. "Sin embargo, en términos de velocidad de datos y rango dinámico, de lo que es capaz la AGIPD es increíble ".

El novedoso software de análisis cristalográfico y reducción de datos diseñado específicamente para hacer frente a los desafíos exclusivos de los conjuntos de datos masivos en cristalografía XFEL, cuyo desarrollo fue liderado por colaboradores de CFEL, DESY, y ASU, han recorrido un largo camino desde el primer experimento XFEL de alta resolución en 2011.

"Nuestro software y las capacidades informáticas de alto rendimiento de DESY realmente se están poniendo a prueba con los volúmenes de datos sin precedentes generados en EuXFEL. Siempre es emocionante superar los límites de la tecnología de vanguardia, "agrega Zatsepin.

Proteínas de membrana:floja, pero formidable

Las proteínas de membrana como el PSI, llamado así porque están incrustadas en las membranas celulares, son vitales para todos los procesos de la vida, incluida la respiración, función nerviosa, absorción de la nutrición, y señalización célula-célula. Como se encuentran en la superficie de cada célula, también son los objetivos de fármacos farmacéuticos más importantes. Más del 60% de todos los fármacos actuales se dirigen a proteínas de membrana. Por tanto, el diseño de fármacos más eficaces con menos efectos secundarios depende de la comprensión de cómo determinados fármacos se unen con sus proteínas diana y sus conformaciones estructurales y actividades dinámicas altamente detalladas.

A pesar de su enorme importancia en biología, Las estructuras proteicas de la membrana constituyen menos del 1% de todas las estructuras proteicas resueltas hasta la fecha porque son notoriamente difíciles de aislar. caracterizar y cristalizar. Es por esto que los grandes avances en los métodos cristalográficos, como el advenimiento de la cristalografía de femtosegundos en serie de megahercios de proteínas de membrana, indudablemente van a tener un impacto significativo en la comunidad científica.

Se necesita un pueblo

Estos logros recientes no serían posibles sin el esfuerzo incansable de un equipo dedicado de casi 80 investigadores de 15 instituciones, incluyendo ASU, el XFEL europeo, DESY, el Centro de Ciencia de Rayos X Ultrarrápidos, Instituto Hauptman-Woodward, SUNY Buffalo, SLAC, Universidad de Hamburgo, Universidad de Goettingen, Academia de Ciencias de Hungría, Universidad de Tennessee, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Universidad de Southampton, Universidad Tecnológica de Hamburgo, Universidad de Wisconsin. El grupo de investigación incluyó colaboradores estadounidenses en el Centro de Ciencia y Tecnología NSF BioXFEL y un grupo de colaboradores internacionales, incluidos Adrian P. Mancuso y Romain Letrun, científicos líderes en la línea de luz EuXFEL y Oleksandr Yefanov y Anton Barty de CFEL / DESY, quienes trabajaron en estrecha colaboración con el equipo de ASU en el análisis de datos complejos.