Los microscopios ópticos y las pinzas pueden obtener imágenes y manipular objetos a microescala para aplicaciones en biología celular y molecular. La resolución óptica es, sin embargo, obstaculizado por el límite de difracción y, por lo tanto, tanto los microscopios como las pinzas son incapaces de obtener imágenes y manipular nanoobjetos directamente. Las técnicas emergentes en los nanoscopios plasmónicos / fotónicos y las nanotinzas tienen como objetivo lograr una resolución a escala nanométrica, aunque las estructuras de materiales de alto índice pueden causar fácilmente daños mecánicos y fototérmicos a las bioespecímenes a nanoescala.

En un estudio reciente ahora publicado en Luz:ciencia y aplicaciones , Yuchao Li y sus colegas del Instituto de Nanofotónica de China, desarrolló un sistema de microscopio óptico que utiliza células vivas como lentes diminutos para obtener imágenes y manipular objetos más pequeños que la longitud de onda de la luz. Mostraron imágenes de límite de sub-difracción y manipulación de nano-objetos con un dispositivo no invasivo, que construyeron atrapando una celda en una punta de fibra. La célula atrapada formó un biomagnificador que podría magnificar nanoestructuras con una resolución de 100 nm, bajo microscopía de luz blanca. Usando el biomagnificador, Li y col. formó una trampa nano-óptica para manipular con precisión una nanopartícula individual con un radio de 50 nm. La técnica proporciona una herramienta de alta precisión para imágenes ópticas, detección y ensamblaje de bio-nanomateriales sin daño mecánico o fototérmico.

Las imágenes ópticas para manipular objetos pequeños son cruciales para el diagnóstico médico, detección biológica, exploración celular, entrenamiento molecular y ensamblaje de materiales. Las pinzas y los microscopios son dispositivos estándar para la obtención de imágenes sin contacto y la manipulación de muestras diminutas que van desde unos pocos nanómetros hasta varios micrones. Sin embargo, Es un desafío utilizar la tecnología para obtener imágenes a nanoescala, dado que la resolución óptica está restringida a aproximadamente la mitad de la longitud de onda de iluminación.

Los científicos han logrado un progreso espectacular de los nanoscopios y nanotweezers de campo cercano en las últimas décadas para lograr imágenes ópticas con una resolución nanométrica. Estas técnicas de obtención de imágenes fueron retenidas por materiales inorgánicos de alto índice, como metales nobles y semiconductores utilizados para su fabricación, que pueden dañar mecánicamente muestras de células o tejidos biológicos durante la manipulación y obtención de imágenes de campo cercano.

Por lo tanto, los científicos investigaron esquemas de imágenes ópticas más simples basados ​​en microesferas dieléctricas para superar el límite de difracción común a los microscopios convencionales. Si bien la técnica no tiene etiquetas y es factible, tales microesferas se basan en materiales inorgánicos artificiales como el dióxido de silicio (SiO ₂ ), dióxido de titanio (TiO ₂ ) y titanato de bario (BaTiO ₃ ). Por lo tanto, los investigadores están interesados ​​en desarrollar un biomaterial natural para construir un dispositivo biocompatible para la obtención de imágenes biológicas. manipulación y biomagnificación a resolución espacial a nanoescala.

Li y col. células biológicas seleccionadas para reemplazar las microesferas, ya que las células son tanto abundantes como biocompatibles en contacto con sistemas biológicos. Por ejemplo, los científicos pueden utilizar células vivas para manipular la luz en entornos biológicos y actuar como microlentes optofluídicos, sondas ópticas e incluso incorporan E. coli como guías de ondas biofotónicas. En el presente trabajo, Li y col. mejoró el índice de contraste de las células vivas mediante el uso de una forma esférica semi-sumergida en un medio para lograr el enfoque en la sub-longitud de onda. Los científicos capturaron imágenes biológicas utilizando el punto de luz de subdifracción para iluminar muestras específicas junto con microscopía de luz blanca. El punto de luz de tamaño nanométrico ejerció una fuerte fuerza de gradiente óptico para atrapar y manipular una sola nanopartícula, lo que permitió que el biomagnificador también funcionara como un nanotweezer óptico.

Los científicos llevaron a cabo todos los experimentos bajo un microscopio óptico de modo de reflexión acoplado a una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) y un objetivo. Utilizaron fuentes de luz a 390 nm, 560 nm y 808 nm para excitación, iluminación y atrapamiento respectivamente. Usando una fibra óptica con una punta cónica, Li y col. atrapó el biomagnificador al final de la fibra, que controlaron moviendo la punta con un micromanipulador. Li y col. seleccionó celdas lisas y esféricas para minimizar la aberración de la imagen y observó que las celdas exhibían un mejor rendimiento de enfoque cuando se semi sumergían en la solución para mantener la viabilidad celular.

Durante la obtención de imágenes experimentales, los científicos colocaron un biomagnificador semisumergido encima de una muestra de prueba y recolectaron la información subyacente de campo cercano de la muestra, para formar una imagen virtual detectada por un microscopio óptico. Li y col. preparó una variedad de biomagnificadores utilizando diversas células, incluidas bacterias, levadura, glóbulos rojos y células madre. Para la primera muestra de imagen, utilizaron una matriz de nanoesferas de sílice hexagonal bidimensional con un diámetro de 200 nm sobre un sustrato de vidrio utilizando una técnica fotoforética.

Solo las nanoesferas con biomagnificadores encima podrían resolverse durante la obtención de imágenes, mientras que las nanoesferas sin biomagnificadores no podrían resolverse con un microscopio convencional. Se determinó que el factor de aumento M de los biomagnificadores basados ​​en células madre era 3,3 veces mayor (x3,3), y los científicos demostraron que la M experimental dependía del diámetro del biomagnificador. Después, Li y col. realizó todos los experimentos utilizando biomagnificadores de este diámetro.

Para investigar las aplicaciones de los biomagnificadores, Li y col. Se obtuvieron imágenes de células epiteliales humanas como objetivos de imagen mediante el crecimiento de células epiteliales en un sustrato de espejo para mejorar las interacciones luz-materia a través de la interferencia de la luz de iluminación y la luz de reflexión. Si bien fue difícil distinguir el citoesqueleto fibroso y las estructuras bicapa con un microscopio óptico convencional, después de colocar un biomagnificador encima de las células epiteliales, los científicos pudieron resolver ambas estructuras. Para mejorar el campo de visión de la imagen (FOV), atraparon el biomagnificador en una punta de fibra y lo movieron para escanear las muestras. Por ejemplo, Li y col. usó la configuración para escanear letras con nanopatrones que representaban el acrónimo de la Universidad de Jinan, JNU, que crearon por primera vez en silicio utilizando litografía por haz de electrones.

Después de eso, cuando irradian simultáneamente rayos láser de infrarrojo cercano (IR) y ultravioleta en el biomagnificador a través de una lente de objetivo, podrían atrapar y excitar las nanopartículas. Para estos experimentos, los científicos utilizaron nanopartículas fluorescentes con un radio promedio de 50 nm. Cuando atraparon una sola nanopartícula en el foco de un biomagnificador, observaron imágenes tanto ópticas como fluorescentes de la muestra de interés. Li y col. luego calculó la rigidez de atrapamiento de la partícula en tiempo real usando pinzas ópticas estándar. La capacidad de manipular una sola nanopartícula sin contacto y con precisión a través de la óptica será útil para ensamblar nanoestructuras bien reguladas. Cuando Li et al. investigó numéricamente el mecanismo de obtención de imágenes y la rigidez de captura de los biomagnificadores utilizando simulación 3D y software COMSOL. Observaron que la capacidad de enfoque de la luz con límite de subdifracción era el resultado de un efecto combinado de "nanojet fotónico" y una mejora de la interferencia coherente por parte del espejo.

Las limitaciones del método incluyeron la aberración y distorsión de la imagen debido a las estructuras intracelulares no homogéneas del biomagnificador natural, en comparación con las microesferas dieléctricas con índices de refracción uniformes. Afortunadamente, Los materiales intracelulares eran ópticamente transparentes a la luz visible y al infrarrojo cercano y las interacciones ópticas eran relativamente débiles dentro de una sola célula. Las actividades intracelulares también podrían cambiar la distribución del índice de refracción parcial en una célula para causar distorsión de la luz durante la captura y la obtención de imágenes. pero la mayoría de las actividades intracelulares fueron ultrarrápidas y no influyeron en el esquema de imagen.

De este modo, Yuchao Li y sus colegas desarrollaron una nueva técnica de imagen experimental y verificaron las capacidades experimentales con simulaciones FEM. Li y col. nanoscopios ópticos y nanotweezers integrados en un solo dispositivo para obtener imágenes y manipular nanoestructuras simultáneamente por primera vez en el presente trabajo. Promovieron la resolución de la técnica a 100 nm y propusieron un procedimiento de imagen sin etiqueta. Los científicos visualizan el biomagnificador viviente para abrir nuevas oportunidades en imágenes de superresolución, detección en tiempo real y nanoensamblaje preciso de bionanomateriales para formar nanoarquitecturas de interés.

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