Una técnica novedosa desarrollada por investigadores del Centro de Excelencia ARC para Biofotónica a nanoescala (CNBP) ayudará a arrojar nueva luz sobre cuestiones biológicas al mejorar la calidad y cantidad de información que se puede extraer en microscopía de fluorescencia.

La técnica, La 'microscopía multicanal asistida por blanqueamiento' (BAMM) toma una debilidad actual de larga data de la microscopía de fluorescencia, el fotoblanqueo, y la convierte en una fuerza que mejora la producción de imágenes hasta tres veces. sin necesidad de hardware adicional.

Reportado en la revista Óptica Biomédica Express , BAMM ayudará a los investigadores a obtener conocimientos biológicos sobre los intrincados procesos que tienen lugar dentro de las células vivas. Esto incluye la interacción entre proteínas y moléculas que tienen el potencial de afectar una amplia gama de áreas de salud desde la fertilidad, al dolor, a enfermedades del corazón y más.

"La microscopía de fluorescencia es una de las técnicas más utilizadas en biología. Aquí es donde las moléculas emisoras de luz llamadas fluoróforos se unen a objetivos celulares extremadamente pequeños como las proteínas, material genético u otras biomoléculas de interés, "dice el Dr. Antony Orth, Miembro de investigación del CNBP en la Universidad RMIT y autor principal del artículo de investigación.

"Cuando el fluoróforo es excitado por la luz del microscopio, reacciona emitiendo una firma de color específica. Ver esa firma de color bajo el microscopio nos ayuda a ver, rastrear y comprender el objetivo celular al que se ha unido el fluoróforo ".

En particular, dice el Dr. Orth, puede unir fluoróforos de diferentes colores a diferentes objetivos celulares, todo en una muestra, para maximizar los datos y la información de imágenes que se recibe.

Este enfoque tradicional de la microscopía de fluorescencia es versátil, pero hay una limitación importante:el espectro visible (o de color), donde operan la mayoría de los fluoróforos, puede llenarse de gente. En un experimento ideal, cada objetivo debe elegirse para tener una emisión de color distinta, pero esto se vuelve cada vez más difícil de organizar a medida que aumenta el número de objetivos.

"El espectro de color visible abarca un rango de 400 nanómetros (nm) a 700 nm y solo unos 200 nm de este rango están disponibles para la emisión de colores de fluorescencia, "explica el Dr. Orth.

"Un fluoróforo típico emite en un rango de 50 nm del espectro de color. Dividir 200 nm del espectro visible en segmentos de 50 nm significa que los colores de los emisores fluorescentes comienzan a mezclarse cuando se intenta exprimir más de cuatro colores".

"Esto generalmente limita a los investigadores a cuatro o menos objetivos fluorescentes en una muestra, "dice el Dr. Orth.

"Típicamente, la mayoría de los experimentos son incluso menos ambiciosos, incorporando sólo dos o tres objetivos. El meollo del problema es que sólo una propiedad del fluoróforo, su color, se utiliza para la identificación ".

Para ayudar a superar esta limitación, El Dr. Orth y sus co-investigadores han desarrollado una técnica innovadora llamada 'microscopía multicanal asistida por blanqueamiento' (BAMM) para aumentar su producción de imágenes.

"En lugar de utilizar el color para diferenciar los fluoróforos, Usamos la cuarta dimensión del tiempo y explotamos un fenómeno llamado fotoblanqueo:la atenuación de una colección de fluoróforos o pigmentos bajo exposición repetida a la luz. "dice el Dr. Orth.

"Debido a que cada tipo de fotoblanqueamiento de fluoróforos a un ritmo diferente, podemos diferenciar entre fluoróforos sin utilizar información de color. Usamos la tasa de fotoblanqueo como identificador ".

"Cuando se combina con información de color tradicional, esta dimensión adicional del fotoblanqueo permite a los científicos utilizar 2-3 veces más tipos de moléculas fluorescentes, todo en una muestra. Esto nos permite extraer mucha más información de una sola investigación ".

"Los investigadores podrán diseñar pruebas más informativas, por ejemplo, destacando cinco objetivos cuando anteriormente solo dos eran prácticos. Ya no tendrán que evitar el uso de dos fluoróforos del mismo color, Dado que una diferencia en la fotoestabilidad por sí sola es suficiente para distinguir entre los dos objetivos, " él dice.

Tradicionalmente, el fenómeno del fotoblanqueo (o decoloración) ha sido perjudicial para el proceso de microscopía fluorescente. Aquí es donde la iluminación continua y de alta intensidad del microscopio destruye permanentemente la capacidad de un fluoróforo para emitir fluorescencia, por lo que la obtención de imágenes del objetivo celular se vuelve imposible.

"BAMM transforma el fotoblanqueo de una debilidad de larga data de la microscopía de fluorescencia en una fuerza significativa para permitir una mayor identificación de los objetivos celulares, "dice el Dr. Orth.

"BAMM no requiere ningún hardware adicional, es comparativamente sencillo de hacer y no requiere ninguna preparación de muestras especializada. Es un nuevo enfoque extremadamente emocionante que tiene el potencial de beneficiar a todos los usuarios de microscopía de fluorescencia y su ciencia exploratoria. " él dice.

Los investigadores que participaron formalmente en el proyecto BAMM estaban afiliados a CNBP (Universidad RMIT y Universidad de Adelaida) y Thermo Fisher Scientific.