La fluorescencia es una herramienta increíblemente útil para la biología experimental y ahora es más fácil de aprovechar, gracias al trabajo de un grupo de investigadores de la Universidad de Chicago.

El grupo creó una nueva herramienta como parte de una clase de laboratorio dentro del programa de posgrado en Ciencias Biofísicas de la Universidad de Chicago. permitiendo a sus usuarios concentrarse en el espectro de estructuras específicas dentro de las muestras.

"La mayor parte del trabajo fue realizada por estudiantes graduados durante su primer semestre, "dijo Adam Hammond, director de currículo y profesor titular del programa de Ciencias Biofísicas del Centro Gordon de Ciencias Integrativas. "Su entusiasmo y creatividad hicieron posible este proyecto".

Como informa el grupo esta semana en la revista Revisión de instrumentos científicos , de AIP Publishing, el objetivo de su instrumentación es observar el espectro de luz que proviene de parte de una muestra en un microscopio, pero no toda la muestra.

"El valor de un microscopio es que le permite observar las variaciones dentro de una muestra, "Explicó Hammond." Queríamos poder preguntar, '¿Cuál es el espectro de esa estructura específica?' Este no es un nuevo deseo y existen instrumentos que pueden hacerlo, pero ninguno, por lo que sé, tan simplemente como el nuestro ".

Durante su primer año en la escuela de posgrado, Peter Dahlberg, primer autor del artículo que ahora se encuentra en la Universidad de Stanford en California, Llegué a construir un microscopio de excitación selectiva. "De modo subconsciente, Creo que la idea empezó entonces ", dijo." ¿Por qué no hacer lo mismo, pero al revés? "

¿Cómo funciona la herramienta del grupo? Primero, divide la luz que proviene de una muestra. La mitad va a una cámara para obtener imágenes normales y la otra mitad va a un espectrómetro. Pero antes de que llegue al espectrómetro, esa mitad pasa a través de algunos componentes ópticos que permiten a los usuarios elegir cualquier parte arbitraria de la imagen y bloquear todo lo demás.

"No hay nada complicado en estos componentes ópticos:un modulador de luz espacial (SLM) entre polarizadores cruzados, "Hammond dijo." Los SLM son comunes ahora, con al menos tres en muchos proyectores digitales modernos. Tienen una serie de píxeles que pueden manipular la fase de la luz que pasa a través de ellos ".

Aunque hay varios trucos que puedes hacer con un SLM, el grupo está utilizando el más sencillo.

"Enfocamos la imagen de la muestra en el SLM y cambiamos la fase de solo aquellos píxeles de los que queremos obtener un espectro, "continuó." La luz desplazada pasa a través de un segundo polarizador; todo lo demás queda bloqueado. Luego, esa luz se recolecta y se puede enviar a cualquier tipo de instrumento óptico que elija. Ahora mismo lo enviamos a un pequeño espectrómetro UV / Vis para obtener un espectro completo ".

El instrumento del grupo es, quizás, resumido mejor como una "herramienta de caballo de batalla". Sus conceptos y componentes simples se pueden adaptar fácilmente para muchos propósitos diferentes y agregarse a los microscopios existentes de manera fácil y económica.

"Nos propusimos construirlo para un uso específico:medir el cambio espectral de indicadores fluorescentes, "Dijo Hammond." Realmente no pensamos en hacerlo versátil o en cómo organizar el SLM y los polarizadores cuando comenzamos. Pero tuvimos una serie agradable de realizaciones a lo largo del camino ".

Uno de esos descubrimientos fue que su instrumento también podría usarse para mediciones de absorbancia.

"A menudo, las muestras más importantes son pequeñas y difíciles de crear o purificar, como formas de cristal, "Dijo." Es un trabajo arduo purificar los dos tipos entre sí en cantidades suficientes para llenar una cubeta. Cuando pones la mezcla en un portaobjetos de microscopio, se vuelve más fácil. Los cristales se pueden medir de uno en uno, y también las células que expresan cromóforos variables (moléculas responsables del color). Esto abre un área completamente nueva que no formaba parte de nuestro plan original ".

El instrumento del grupo puede "tomar el espectro completo de una o más regiones de interés definidas por el usuario mientras captura simultáneamente imágenes de fluorescencia estándar de todo el campo de visión, "Dijo Hammond." Entonces, lo que puedas hacer con él depende de la muestra. Lo estamos usando ahora para seguir las sondas fluorescentes de pH y calcio. Pero un ejemplo de una aplicación muy diferente es su capacidad para identificar microorganismos individuales dentro de una muestra mixta por su huella dactilar de absorbancia ".

¿Qué sigue para los investigadores?

"Al utilizar una fuente de excitación pulsada, la vida útil de la fluorescencia de una sonda podría medirse a partir de una región de interés seleccionada, "dijo Hammond." Una aplicación potencial interesante está dentro del campo de la neurociencia para resolver potenciales de acción únicos con tintes que son sensibles al potencial de membrana. Las mediciones de la vida útil de la fluorescencia proporcionan una ventaja sobre las mediciones de fluorescencia directas porque son independientes de la concentración de la sonda ".