Por Andy Pasquesi
Actualizado el 30 de agosto de 2022
Las enzimas aceleran las reacciones químicas al reducir la energía de activación necesaria para la conversión del sustrato. El número de facturación, kcat , cuantifica la eficiencia catalítica de una enzima midiendo el número de moléculas de sustrato convertidas en producto por sitio activo de enzima por segundo en condiciones de saturación del sustrato.
Trazar la concentración del producto versus el tiempo para el primer tubo de ensayo de su ensayo enzimático. Utilice el tiempo en el eje horizontal y la concentración del producto en el eje vertical.
Calcule la pendiente de la porción lineal de la curva (velocidad inicial, V0 ). En Excel o en una calculadora gráfica, la recta de regresión lineal le dará la pendiente directamente. Si prefiere una estimación manual, divida el cambio en la concentración del producto entre dos puntos de datos consecutivos por el cambio correspondiente en el tiempo.
Registre esta pendiente como la velocidad de reacción inicial, V0 , para ese tubo de ensayo. En la ecuación de regresión [Product] = m·time + b , el coeficiente m es V0 .
Repita los pasos 1 a 3 para cada tubo de ensayo del ensayo para obtener una serie de V0 valores a diferentes concentraciones de sustrato.
Cree un gráfico Lineweaver-Burk (doble recíproco):gráfico 1/[S] (concentración de sustrato inversa) en el eje horizontal y 1/V0 (velocidad inicial inversa) en el eje vertical. Por ejemplo, si un tubo de ensayo tiene una concentración de sustrato inicial de 50 μM y un V0 de 80 µMs
–1
, el punto trazado sería (1/50 μM, 1/80 μMs
–1
).
Realice una regresión lineal sobre estos puntos. La ecuación resultante toma la forma 1/V0 = m·(1/[S]) + b , donde b es la intersección en y.
Calcular la inversa de Vmax tomando el recíproco de la intersección con el eje y:1/Vmax = 1/b .
Invierta el valor del paso 3 para obtener Vmax :
Vmax = 1/(1/Vmax) = b
Identifique la concentración de enzima utilizada en el ensayo (este valor es constante en todos los tubos de ensayo y debe informarse en los datos sin procesar).
Calcular kcat dividiendo Vmax por la concentración de enzima:
kcat = Vmax / [E]
Esto produce el número de moléculas de sustrato convertidas por sitio activo de enzima por segundo.
Siguiendo estos pasos sistemáticos:medir velocidades iniciales, construir un diagrama de Lineweaver-Burk y extraer Vmax y normalizando la concentración de enzima:puede determinar con precisión el número de recambio de una enzima, kcat , una métrica fundamental en enzimología y desarrollo de fármacos.
