Hongo Trichoderma reesei cepa RUT-C30, que fue diseñado para producir enzimas de alto rendimiento. Crédito:LNBR-CNPEM
Investigadores del Centro Brasileño de Investigación en Energía y Materiales (CNPEM) han modificado genéticamente un hongo para producir un cóctel de enzimas que descomponen los carbohidratos en la biomasa. como la basura de la caña de azúcar (copas y hojas) y el bagazo, en azúcar fermentable para la conversión industrialmente eficiente en biocombustible.
El desarrollo de cócteles enzimáticos de bajo costo es uno de los principales desafíos en la producción de etanol de segunda generación.
Los biocombustibles de segunda generación se fabrican a partir de diversos tipos de biomasa no alimentaria, incluidos los residuos agrícolas, astillas de madera y aceite de cocina usado. El proceso del grupo de investigación CNPEM allana el camino para un uso optimizado de los residuos de la caña de azúcar para producir biocombustibles.
El hongo Trichoderma reesei es uno de los productores más prolíficos de enzimas que degradan la pared celular de las plantas y se utiliza ampliamente en la industria biotecnológica. Para mejorar su productividad como biofábrica del cóctel de enzimas en cuestión, los investigadores introdujeron seis modificaciones genéticas en RUT-C30, una cepa del hongo disponible públicamente. Patentaron el proceso y lo informaron en un artículo publicado en la revista. Biotecnología para biocombustibles .
"El hongo fue modificado racionalmente para maximizar la producción de estas enzimas de interés biotecnológico. Usando la técnica de edición de genes CRISPR / Cas9, modificamos factores de transcripción para regular la expresión de genes asociados con las enzimas, proteasas eliminadas que causaron problemas con la estabilidad del cóctel de enzimas, y se agregaron enzimas importantes que el hongo carece en la naturaleza. Como resultado, pudimos permitir que el hongo produzca una gran cantidad de enzimas a partir de desechos agroindustriales, una materia prima barata y abundante en Brasil, "Mario T. Murakami, Director Científico del Laboratorio de Biorenovables del CNPEM (LNBR), dijo a Agência FAPESP.
Unos 633 millones de toneladas de caña se procesan por cosecha en Brasil, generando anualmente 70 millones de toneladas métricas de basura de caña (masa seca), según la Empresa Nacional de Abastecimiento de Alimentos (CONAB). Estos residuos se subutilizan para la producción de etanol combustible.
Murakami destacó que prácticamente todas las enzimas que se utilizan en Brasil para descomponer la biomasa son importadas de unos pocos productores extranjeros que mantienen la tecnología bajo protección de secreto comercial. En este contexto, el cóctel de enzimas importado puede representar hasta el 50% del costo de producción de un biocombustible.
"Bajo el paradigma tradicional, Se necesitaron décadas de estudios para desarrollar una plataforma competitiva de producción de cócteles de enzimas, ", dijo." Además, los cócteles no se pudieron obtener únicamente mediante técnicas de biología sintética de cepas disponibles públicamente porque los productores utilizaron diferentes métodos para desarrollarlos, como la evolución adaptativa, exponer el hongo a reactivos químicos, e inducir mutaciones genómicas para seleccionar el fenotipo más interesante. Ahora, sin embargo, gracias a herramientas avanzadas de edición de genes como CRISPR / Cas9, hemos logrado establecer una plataforma competitiva con solo algunas modificaciones racionales en dos años y medio ".
El bioproceso desarrollado por los investigadores del CNPEM produjo 80 gramos de enzimas por litro, el título más alto con apoyo experimental informado hasta ahora para T. reesei a partir de una materia prima a base de azúcar de bajo costo. Esto es más del doble de la concentración previamente reportada en la literatura científica para el hongo (37 gramos por litro).
"Un aspecto interesante de esta investigación es que no se limitó al laboratorio, ", Dijo Murakami." Probamos el bioproceso en un entorno de producción semiindustrial, ampliarlo para una planta piloto para evaluar su viabilidad económica ".
Aunque la plataforma fue personalizada para la producción de etanol celulósico a partir de residuos de caña de azúcar, añadió, puede descomponer otros tipos de biomasa, y los azúcares avanzados se pueden utilizar para producir otras energías renovables como plásticos y productos químicos intermedios.
Clase de enzima novedosa
El proceso fue el resultado práctico (en términos de una aplicación industrial) de una amplia investigación realizada por LNBR para desarrollar enzimas capaces de descomponer los carbohidratos. En otro estudio apoyado por la FAPESP y publicado en Biología química de la naturaleza , los investigadores revelaron siete nuevas clases de enzimas presentes sobre todo en hongos y bacterias.
Las nuevas enzimas pertenecen a la familia de la glucósido hidrolasa (GH). Según Murakami, Estas enzimas tienen un potencial significativo para aplicaciones no solo en el campo de los biocombustibles sino también en la medicina. procesamiento de alimentos y textiles, por ejemplo. Las enzimas inspirarán nuevos procesos industriales al aprovechar las diferentes formas en que la naturaleza descompone los polisacáridos (carbohidratos compuestos por muchos azúcares simples).
Estas enzimas descomponen los betaglucanos, algunos de los polisacáridos más abundantes que se encuentran en las paredes celulares de los cereales, bacterias y hongos, y una gran fracción de la biomasa disponible en el mundo, indicando el uso potencial de las enzimas en conservantes de alimentos y textiles. En el caso de los biocombustibles, la propiedad clave es su capacidad para digerir material rico en fibras vegetales.
"Nos propusimos estudiar la diversidad de la naturaleza en polisacáridos degradantes y cómo este conocimiento se puede aplicar a procesos en diferentes industrias, ", Dijo Murakami." Además del descubrimiento de nuevas enzimas, Otro aspecto importante de esta investigación es el enfoque de red de similitudes que utilizamos para producir un conocimiento profundo y sistemático de esta familia de enzimas. El enfoque nos permitió comenzar desde cero y en un tiempo relativamente corto, llegar a la familia más estudiada de enzimas activas en beta-1, 3-glucanos hasta la fecha, con información disponible sobre especificidad y mecanismos de acción ".
El criterio principal para clasificar las enzimas suele ser la filogenia, es decir., la historia evolutiva de la molécula, mientras que los investigadores del CNPEM se centran en la funcionalidad.
"Gracias a los avances en la tecnología de secuenciación de ADN, ahora tenemos muchas secuencias genéticas conocidas y una capacidad bien establecida para estudiar y caracterizar moléculas y enzimas en términos de su funcionalidad. Como resultado, hemos podido refinar la metodología de la red de similitudes y utilizarla por primera vez para estudiar las enzimas activas en los polisacáridos, "Dijo Murakami.
Usando el enfoque de red de similitud, el grupo clasificó siete subfamilias de enzimas según la funcionalidad. Caracterizando al menos un miembro de cada subfamilia, los investigadores accedieron en términos sistemáticos a la diversidad de estrategias moleculares para degradar los betaglucanos contenidas en miles de miembros de la familia de enzimas.
Tour de force bioquímico
El análisis filogenético se centra en las regiones de ADN que se han conservado a lo largo del tiempo, mientras que la clasificación por funcionalidad se basa en regiones no conservadas asociadas con la diferenciación funcional. "Esto nos dio eficiencia y nos permitió agrupar a más de 1, 000 secuencias en solo siete subgrupos o clases con la misma función, "Dijo Murakami.
Debido a que el enfoque fue novedoso, los investigadores realizaron varios otros estudios para verificar y validar el método de clasificación. De los siete grupos de enzimas capaces de degradar polisacáridos, obtuvieron 24 estructuras completamente nuevas, incluyendo varios complejos sustrato-enzima, considerado crucial para proporcionar información que ayude a comprender los mecanismos de acción involucrados.
El estudio comprendió análisis funcionales y estructurales para comprender cómo actúan estas enzimas sobre los carbohidratos en cuestión. "Los polisacáridos vienen en docenas de configuraciones y son capaces de muchos tipos de enlaces químicos, "Dijo Murakami." Queríamos observar exactamente qué enlaces químicos y arquitecturas son reconocidas por cada enzima. Por esta razón, tenía que ser un estudio multidisciplinario, combinar datos estructurales y funcionales respaldados por análisis mediante espectrometría de masas, espectroscopia, experimentos de mutagénesis y difracción para dilucidar la estructura atómica ".
En la sección "Noticias y reproducciones" del mismo número de Biología química de la naturaleza , Profesor Paul Walton, Catedrático de Química Bioinorgánica de la Universidad de York en el Reino Unido, calificó el estudio de la glucósido hidrolasa como un "tour de force" bioquímico por su enfoque innovador y elogió sus "tremendos conocimientos", y agregó que los investigadores fueron "capaces de expresar y aislar ejemplos de cada clase [de enzimas] para examinar si las diferencias en las secuencias entre las clases se reflejaban en sus estructuras y actividades".