Un equipo de Ciudad del Cabo ha publicado recientemente el primer artículo de microscopía crioelectrónica (EM) de alta resolución que se originó en África. Como se describe en Biología de las comunicaciones de la naturaleza , El equipo resolvió la estructura de una enzima nitrilasa con una resolución cercana a la atómica y utilizó los conocimientos estructurales para diseñar una enzima mutante que podría ajustarse para aplicaciones en biotecnología. Este trabajo fue posible gracias a un programa de acceso financiado por el proyecto Synchrotron Techniques for African Research and Technology, una subvención colaborativa que busca construir asociaciones entre científicos líderes mundiales en África y el Reino Unido que trabajan juntos en la investigación utilizando la ciencia de sincrotrón.

Las nitrilasas son una clase fascinante de enzimas vegetales que son actores importantes en la síntesis de una amplia gama de sustancias químicas importantes. Estas enzimas suelen tener especificidad para una pequeña gama de sustratos, sin embargo, tienen un enorme potencial biotecnológico. Un equipo de científicos de la Universidad de Ciudad del Cabo se propuso aprovechar este potencial investigando la estructura de las enzimas utilizando crio-EM en el Centro de Bioimagen de Electrones (eBIC).

Después de lograr obtener información estructural de alta calidad, el equipo obtuvo una imagen de resolución casi atómica (3,4 Å) de una nitrilasa derivada de la familia de las coles. Usando esta estructura, el equipo diseñó semi-racionalmente una nueva nitrilasa mutante que actuaba sobre sustratos no catalizados por ninguna otra nitrilasa natural.

El equipo espera poder progresar en la fabricación de nitrilasas de 'diseño' para cualquier sustrato que necesite la industria, ya sean productos farmacéuticos, productos químicos finos o incluso alimentos. Se planea más trabajo en el eBIC para continuar con este fructífero estudio.

Giros helicoidales

Las nitrilasas son una clase de enzimas que se utilizan para producir ácidos carboxílicos, amoniaco y amidas para la síntesis a gran escala de medicamentos y productos químicos de importancia industrial. Un equipo de científicos de la Universidad de Ciudad del Cabo estaba fascinado con estas enzimas y quería estudiar cómo evolucionaron y correlacionaron su estructura y función.

El grupo inicialmente comparó dos nitrilasas diferentes de Arabidopsis thaliana (un miembro de la familia de las coles) y vio que uno tenía una amplia gama de sustratos, pero el otro era mucho más específico para una pequeña cantidad de sustratos. Llevaron a cabo una serie de mutaciones en el bolsillo de unión de las enzimas y descubrieron que cambiar un solo aminoácido cambiaba la preferencia de sustrato de las nitrilasas. Con este tentador conocimiento, el grupo decidió obtener información estructural detallada para revelar cómo las nitrilasas escogen sus sustratos.

Dr. Jeremy Woodward, El profesor de bioquímica médica de la Universidad de Ciudad del Cabo e investigador principal del estudio explicó las motivaciones de su grupo,

"Para tratar de averiguar qué estaba pasando, obtuvimos imágenes de todas las enzimas utilizando crio-EM de baja resolución en la Universidad de Ciudad del Cabo y descubrimos que formaban filamentos, y que la tensión de su torsión helicoidal se correlacionó con el tamaño del sustrato. De hecho, el aminoácido que descubrimos estaba ubicado en una interfaz entre dos subunidades helicoidales. Hemos observado esta correlación con una gran cantidad de enzimas nitrilasas, pero no podía explicar lo que estaba sucediendo a nivel molecular hasta nuestra reciente visita a eBIC en Diamond Light Source ".

Estructura cercana a la atómica

El equipo había utilizado previamente microscopía electrónica (EM) de tinción negativa, que está limitada a una resolución de 20 Å, y no es lo suficientemente alto para ver detalles atómicos en la estructura. Adicionalmente, El trabajo previo de otros laboratorios había demostrado que las nitrilasas no se pueden cristalizar, así que cryo-EM era su única opción.

"Este era el único método que podía utilizarse para responder a las preguntas que tenían, "explicó la Dra. Adriana Klyszejko, asociado de investigación postdoctoral en el eBIC que ayudó con el estudio. "En Diamond, lo que hemos creado es un esfuerzo integrado para nuestra comunidad de usuarios donde pueden impulsar su investigación más ".

En el eBIC, el equipo obtuvo una estructura con una resolución de 3,4 Å. Dr. Woodward, elaborado:

"La alta calidad de los datos que obtuvimos nos permitió visualizar la estructura de un filamento helicoidal de nitrilasa intacto con una resolución cercana a la atómica por primera vez. Observamos un bucle, mantenido en posición por el aminoácido que descubrimos, que limita el tamaño máximo de los sustratos encuadernados y se desplaza con un giro helicoidal ".

La subvención START

El trabajo fue posible gracias a una subvención de técnicas de sincrotrón para la investigación y la tecnología africanas (START); una iniciativa creada en marzo de 2019 para crear asociaciones entre científicos de África y el Reino Unido. START está financiado por una subvención de £ 3.7 millones del Consejo de Instalaciones de Ciencia y Tecnología (STFC) de UKRI del Fondo de Investigación de Desafíos Globales (GCRF). El STFC otorgó la financiación del GCRF, un fondo de 1.500 millones de libras esterlinas a 5 años que es un componente clave en la ejecución de la estrategia de ayuda del Reino Unido, Garantizar que la investigación del Reino Unido asuma un papel de liderazgo a la hora de abordar los problemas que enfrentan los países en desarrollo a través de la investigación y la innovación.

La motivación para START proviene de los desafíos sociales que enfrentan las comunidades africanas; por ejemplo, 600 millones de personas (70%) en África subsahariana viven sin electricidad, y un suministro eléctrico confiable es una de las herramientas más poderosas para sacar a las personas de la pobreza y poner fin a su dependencia de la ayuda. Los investigadores de START investigarán materiales energéticos, incluidas las estructuras de células solares, catalizadores y baterías. El desarrollo de la asistencia sanitaria en África se ve obstaculizado por la falta de un conocimiento fundamental de la causa de enfermedades como la malaria o el VIH. La biología estructural ofrece una visión sin precedentes de los mecanismos detrás de estas enfermedades.

Además de proporcionar acceso a las instalaciones de clase mundial en el eBIC a los científicos de Sudáfrica, la beca también apoyó a científicos postdoctorales, Dr. Andani Mulelu, quien fue el investigador principal del estudio. "Este trabajo no hubiera sido posible sin esto, porque el equipo, el apoyo y la infraestructura necesarios para llevar a cabo con éxito este experimento no están disponibles en África, "explicó el Dr. Woodward.

Dr. Gwyndaf Evans, Científico principal de la línea de luz en la línea de luz VMXm de Diamond, e Investigador Principal de Ciencias de la Vida para el proyecto START comenta:

"La iniciativa START tiene como objetivo, entre otras cosas, para ayudar a desarrollar la experiencia y la capacidad para la biología estructural en África. Inicialmente, estamos poniendo énfasis en facilitar el acceso a las instalaciones de biología estructural de Diamond a través de cursos de capacitación enfocados en Sudáfrica y localmente aquí en Diamond. El objetivo final es demostrar a los organismos de financiación africanos el poder y los beneficios de la biología estructural para abordar los problemas africanos en la salud humana y la agricultura para hacer de la biología estructural una actividad sostenible en el continente. Ver a expertos como Jeremy Woodward lograr un puesto permanente en Sudáfrica es un buen augurio para el futuro y ayuda a construir esta sostenibilidad ".

Nitrilasas de diseñador

Utilizando los conocimientos adquiridos de la estructura crio-EM de alta resolución, el equipo proyectó más de 5, 000 mutantes para diseñar una nueva enzima con un giro helicoidal alterado que actúa sobre un nuevo conjunto de sustratos no catalizados por ninguna otra nitrilasa vegetal. Esto se llevó a cabo identificando los aminoácidos "puntos calientes" para la evolución dirigida y seleccionándolos acoplando la supervivencia de las bacterias a la conversión exitosa de una biblioteca de sustratos.

Sobre la base de este trabajo, el equipo espera afinar las nitrilasas para desarrollar todo su potencial biotecnológico. "Nos gustaría llegar al punto en el que podamos producir nitrilasas de 'diseñador' para cualquier sustrato realizando los cambios apropiados en la torsión helicoidal y en la cavidad de unión. Para lograr esto, nos gustaría visualizar una colección de nitrilasas clave con un rango de diferentes estados helicoidales (y especificidades de sustrato) mediante crio-EM de alta resolución, "concluyó el profesor Woodward.