Varios métodos de estimación de posición central basados ​​en imágenes (denominados "ajuste de centroide"), como los métodos de ajuste gaussiano 2-D, se han utilizado comúnmente en microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) para determinar con precisión la ubicación de cada fluoróforo. Sin embargo, sigue siendo un desafío mejorar la precisión de localización lateral de una sola molécula a escala molecular ( <2 nm) para obtener imágenes de nanoestructuras de alto rendimiento.

En un estudio publicado en línea en Métodos de la naturaleza , El profesor Xu Tao y el profesor Ji Wei del Instituto de Biofísica de la Academia de Ciencias de China desarrollaron un nuevo proceso de microscopía de localización interferométrica de una sola molécula con iluminación estructurada de modulación rápida, denominada Exposición selectiva óptica repetitiva (ROSE).

ROSE utiliza seis franjas de interferencia de fase y dirección diferentes para excitar las moléculas fluorescentes. La intensidad de las moléculas fluorescentes está estrechamente relacionada con la fase de las franjas de interferencia. Una molécula de fluorescencia se localiza por las intensidades de múltiples patrones de excitación de una franja de interferencia, proporcionando una mejora del doble en la precisión de la localización. Esta técnica ha llevado la resolución de la microscopía de localización de una sola molécula (SMLM) a menos de 3 nm (precisión de localización de ~ 1 nm).

Los investigadores primero diseñaron tres rejillas de celosía diferentes de estructuras de origami de ADN con 5-, Espaciado de punto a punto de 10 y 20 nm para verificar el rendimiento de ROSE. Tanto el ajuste de centroide convencional como ROSE podrían resolver la estructura de 20 nm con el mismo presupuesto de fotones. ROSE también podría resolver claramente la distancia de 10 nm, que no se pudo resolver mediante ajuste de centroide.

Los investigadores demostraron que ROSE podría resolver una estructura de 5 nm a una resolución de ~ 3 nm en un gran campo de visión de 25 x 25 μm. ² , lo que significa que ROSE tiene la capacidad de impulsar el poder de resolución de SMLM a la escala molecular.

Además, utilizando ROSE para analizar nanoestructuras celulares, los investigadores demostraron que ROSE tiene ventajas para resolver la estructura hueca de filamentos de microtúbulos individuales, pequeñas fosas recubiertas de clatrina (CCP) y nanoestructuras celulares de filamento de actina. El análisis de correlación de anillo de Fourier (FRC) indicó que ROSE mejoró la resolución final al doble en comparación con el método de ajuste del centroide.

ROSE puede extenderse a imágenes en 3D a escala nanométrica mediante la introducción de patrones de excitación adicionales a lo largo de la dirección axial. Los investigadores prevén que este método podría extender la aplicación de SMLM en el análisis dinámico de biomacromoléculas y estudios estructurales a escala molecular.