Uno de los desafíos clave de la proteómica, el estudio de todas las proteínas expresadas por una célula u organismo, es distinguir entre moléculas que son estructuralmente diferentes pero que tienen la misma masa. Esto es difícil porque un espectrómetro de masas, el principal aparato utilizado en este tipo de estudio, funciona como una balanza, clasificar las moléculas analizadas según su masa.

Una forma de reducir la confusión cuando se usa un espectrómetro de masas es comenzar enviando la muestra a cromatografía líquida, que separa las proteínas hidrofílicas ("amantes del agua") de las hidrofóbicas. Las proteínas hidrofílicas entran primero en el espectrómetro, y los más hidrofóbicos se dejan para el final, disminuyendo la probabilidad de que dos moléculas diferentes con masas equivalentes sean interpretadas como una sola por el aparato.

"Es como resolver un rompecabezas con millones de piezas. Cuando abres la bolsa por primera vez, las piezas están todas revueltas y superpuestas. Debe comenzar clasificándolos. Mientras trabajamos con proteómica, nos esforzamos constantemente por desarrollar técnicas de clasificación más refinadas, "dijo Daniel Martins-de-Souza, quien dirige el Laboratorio de Neuroproteómica de la Universidad de Campinas (UNICAMP) en Brasil.

En un estudio con resultados recientemente publicado en Proteómica , El grupo de Martins-de-Souza optimizó un método para aumentar la resolución del análisis proteómico por espectrometría de masas. Gracias a una combinación de otras dos técnicas, cromatografía líquida bidimensional y movilidad iónica, el grupo logró identificar 10, 390 proteínas expresadas en oligodendrocitos, las células del sistema nervioso central responsables de producir mielina, sustancia lipídica que juega un papel fundamental en el intercambio de información entre neuronas.

Con el apoyo de la FAPESP, el grupo UNICAMP ha estudiado el proteoma de oligodendrocitos humanos durante varios años, con el objetivo de comprender mejor las causas de la esquizofrenia como base para proponer nuevos enfoques terapéuticos. "Ahora tenemos una base de datos de proteínas de oligodendrocitos mucho más completa, que será de utilidad para nuestros propios estudios y los de otros investigadores en el campo, ", Dijo Martins-de-Souza." Está disponible en línea, y los datos se pueden descargar. Además, la técnica de optimización se puede utilizar para estudiar el proteoma de cualquier muestra biológica ".

En un estudio anterior que utilizó cromatografía líquida unidimensional para la clasificación previa, el grupo había identificado solo 2, 290 proteínas en oligodendrocitos.

Según Martins-de-Souza, los tratamientos actualmente disponibles para la esquizofrenia se centran en las neuronas, pero las fallas de comunicación neuronal observadas en los pacientes pueden deberse a una disfunción de los oligodendrocitos. "Una de nuestras líneas de investigación consiste en evaluar cómo los fármacos utilizados para el control de la esquizofrenia modifican el proteoma de oligodendrocitos, ", dijo." Con esta nueva metodología, podemos obtener cinco veces más información sobre el papel de estos fármacos ".

El estudio se realizó durante la investigación postdoctoral de Juliana Silva Cassoli y la investigación de maestría de Caroline Brandão Teles, ambos con becas de la FAPESP y supervisión de Martins-de-Souza. El primer paso en el análisis proteómico mediante espectrometría de masas es descomponer las proteínas extraídas de la muestra biológica de interés, que en este caso consiste en oligodendrocitos, en partículas más pequeñas llamadas péptidos.

"Una proteína pequeña puede dar lugar a al menos 10 péptidos diferentes. El espectrómetro no es bueno para analizar la molécula completa debido a su gran tamaño, ", Explicó Martins-de-Souza.

Próximo, el grupo sometió la muestra a separación por cromatografía. En lugar de utilizar una única matriz, como en la técnica convencional, usaron dos. En la primera separación sólo una quinta parte de los péptidos inyectados entró en el espectrómetro en forma líquida. A esto le siguió otro quinto en la segunda separación, etcétera.

"Es como si extendieras las piezas del rompecabezas con ambas manos en lugar de solo una, "Dijo Martins-de-Souza.

Dentro del espectrómetro, la muestra se transforma en gas y vuela de un lado a otro en el vacío. Cuanto más pequeño es el péptido, cuanto más rápido llega a su destino, y el aparato luego mide su masa.

Mientras las moléculas vuelan dentro del espectrómetro, la técnica de movilidad iónica inyecta una pequeña cantidad de gas en el aparato a través de un tubo.

"La resistencia que ofrece la molécula al gas depende de su forma tridimensional, Entonces, si dos péptidos diferentes con la misma masa vuelan juntos e inyectamos el gas en la dirección opuesta, tenderán a separarse por la fuerza de resistencia al gas. Es como coger dos hojas de papel de la misma masa, arrugando uno en una bola, y soltándolos a ambos. Por su forma, la sábana arrugada llegará primero al suelo, ", Explicó Martins-de-Souza.

Al final del experimento, los más de 223, 000 péptidos identificados por el espectrómetro fueron reconstruidos utilizando herramientas bioinformáticas, resultando en el 10, 390 proteínas descritas en el artículo. El grupo también utilizó bioinformática para mapear los compartimentos celulares en los que se encuentran las proteínas y los procesos biológicos en los que están involucradas.

"Idealmente, debería ser posible identificar al menos dos péptidos por proteína. De esa manera, podemos estar seguros de que hay una molécula realmente presente en la muestra, since two proteins with two exactly identical peptides are unlikely to occur. En este estudio, about 20% of the proteins were identified by more than 20 peptides, " Martins-de-Souza said.

The methodology enabled the researchers to identify even proteins that were relatively scarce in the sample, es decir., in quantities some 10 million times smaller than those of the most highly expressed molecules.

"One of the problems with mass spectrometry is that a very large piece of the jigsaw puzzle may hide several smaller ones. However, with an effective tool to spread out the pieces, you can see practically all of them, " Martins-de-Souza said.