Aislar una proteína de membrana requiere un proceso de varios pasos, teniendo en cuenta las características específicas de la proteína y el resultado deseado. Aquí hay una descripción general del proceso:
1. Lisis celular:
* interrumpir la membrana celular: Esto es crucial para liberar las proteínas de la membrana de la célula. Existen varios métodos, incluyendo:
* Sonicación: Usando ondas de sonido para romper la membrana celular.
* Press French: Aplicando alta presión para forzar las células a través de una abertura estrecha.
* Detergentes: Uso de detergentes como Triton X-100 o CHAP para solubilizar la membrana celular.
* Enzimas: Usando enzimas como la lisozima para descomponer la pared celular en células bacterianas.
* Elegir el método correcto: El método depende del tipo de célula, las propiedades de la proteína de membrana y el objetivo experimental. Por ejemplo, se prefieren métodos suaves como la sonicación para proteínas delicadas.
2. Fraccionamiento celular:
* Separando componentes de células: Después de la lisis, el lisado celular contiene varios componentes como orgánulos, citoplasma y fragmentos de membrana. El fraccionamiento celular separa estos componentes en función de su tamaño, densidad y otras propiedades.
* Técnicas utilizadas:
* Centrifugación diferencial: Este método gira el lisado a velocidades crecientes a componentes separados según las tasas de sedimentación.
* Centrifugación de gradiente de densidad: Este método utiliza un gradiente de densidad (por ejemplo, sacarosa) para separar los componentes según su flotabilidad.
* Cromatografía de afinidad: Este método utiliza interacciones específicas entre la proteína de la membrana y un ligando unido a una matriz sólida para aislar selectivamente la proteína.
3. Solubilización de proteína de membrana:
* Interrupción de la integridad de la membrana: Las proteínas de la membrana son hidrofóbicas y deben solubilizarse para que se purifiquen más. Los detergentes se usan comúnmente para interrumpir la estructura de la membrana y permitir que las proteínas se extraan.
* Elegir el detergente correcto: Los detergentes se eligen en función de sus propiedades, como su concentración crítica de micelas (CMC), su capacidad para solubilizar diferentes proteínas de membrana y su compatibilidad con las aplicaciones aguas abajo.
* Otros métodos: En algunos casos, se pueden usar otros agentes solubilizantes como lípidos, fosfolípidos o detergentes no iónicos para mantener la estructura nativa de la proteína.
4. Purificación de proteínas:
* separando la proteína objetivo: Se utilizan varios métodos para la purificación, que incluyen:
* Cromatografía de afinidad: Este método utiliza una interacción específica entre la proteína objetivo y un ligando unido a una matriz sólida.
* Cromatografía de exclusión de tamaño: Este método separa las proteínas en función de su tamaño.
* cromatografía de intercambio iónico: Este método separa las proteínas en función de su carga.
* Optimización de la purificación: Cada método requiere condiciones específicas, como la composición del tampón, el pH y la temperatura, para lograr una separación óptima.
5. Caracterización de proteínas:
* Confirmando la identidad de la proteína: Una vez aislado, la proteína debe caracterizarse para garantizar su identidad y pureza.
* Técnicas utilizadas:
* SDS-PAGE: Esta técnica separa las proteínas en función de su tamaño, proporcionando información sobre el peso molecular de la proteína.
* Western Blotting: Esta técnica utiliza anticuerpos para detectar la proteína objetivo específicamente, confirmando su identidad.
* espectrometría de masas: Esta técnica identifica y cuantifica la proteína analizando su relación masa / carga.
Consideraciones importantes:
* Estabilidad de la proteína: Las proteínas de la membrana a menudo son delicadas y propensas a la degradación. Mantener condiciones óptimas, incluida la baja temperatura y el tampón apropiado, es crucial durante todo el proceso de aislamiento.
* Preservación de la actividad de proteínas: El método de aislamiento debe apuntar a preservar la actividad biológica de la proteína, especialmente para los estudios funcionales.
* Requisitos específicos: El protocolo específico para aislar una proteína de membrana varía según las características de la proteína, el resultado deseado y los recursos disponibles.
En conclusión, aislar una proteína de membrana es un proceso complejo que requiere una planificación y ejecución meticulosa. Los pasos y técnicas específicas utilizadas varían según la proteína específica y las necesidades experimentales. Al considerar cuidadosamente cada paso, los investigadores pueden aislar y caracterizar con éxito las proteínas de membrana para su posterior estudio.
