1. Obteniendo el gen humano de interés
* Aislamiento del ADN humano: El gen humano deseado se extrae de las células humanas utilizando técnicas como la digestión de la enzima de restricción o la PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
* Síntesis: El gen también se puede sintetizar artificialmente, utilizando la tecnología de síntesis de genes, que a menudo es más eficiente para genes complejos.
2. Preparación del vector plasmídico
* Selección de plásmido: Se elige un vector de plásmido adecuado, a menudo uno con múltiples sitios de clonación (MC), genes de resistencia a los antibióticos y otras características que facilitan la clonación.
* Digestión de la enzima de restricción: El plásmido se abre en sitios específicos utilizando enzimas de restricción, creando "extremos pegajosos" que son compatibles con el gen humano.
3. Ligadura (unión) del gen y el plásmido
* Compatibilidad: Los extremos pegajosos del gen humano y el plásmido linealizado están diseñados para ser compatibles, lo que les permite unirse a través del emparejamiento de bases complementarias.
* enzima ligasa: La ADN ligasa se usa para catalizar la formación de enlaces fosfodiesteros, uniendo permanentemente el gen humano al plásmido.
4. Transformación en bacterias
* Células competentes: Las células bacterianas se hacen "competentes" para tomar ADN por varios métodos, como el choque térmico o la electroporación.
* Introducción: Los plásmidos recombinantes se introducen en las bacterias competentes.
* Selección: Las bacterias que han absorbido con éxito el plásmido se seleccionan al cultivarlas en medios que contienen antibióticos. Solo las bacterias con el plásmido crecerán debido al gen de resistencia a los antibióticos.
5. Verificación y confirmación
* PCR de colonia: La PCR se usa para confirmar la presencia del gen humano dentro de las colonias bacterianas.
* Secuenciación: La secuencia del gen insertado se verifica mediante secuenciación de ADN para garantizar que sea correcta e intacta.
Componentes y consideraciones clave:
* Enzimas de restricción: Estas enzimas cortan el ADN en secuencias específicas, creando fines compatibles para la ligadura.
* ADN ligasa: Esta enzima se une a los extremos de los hilos de ADN.
* Marcadores de resistencia a los antibióticos: Estos genes en el plásmido permiten la selección de bacterias que han incorporado con éxito el plásmido.
* MCS (múltiples sitios de clonación): Esta región del plásmido contiene múltiples sitios de enzimas de restricción, lo que permite la inserción de diferentes genes.
¿Por qué es esto importante?
* Producción de proteínas: Las bacterias recombinantes se pueden usar para producir grandes cantidades de proteínas humanas, como insulina o hormona de crecimiento, con fines terapéuticos.
* Herramientas de investigación: Los plásmidos recombinantes son esenciales para la clonación de genes y los estudios de expresión génica.
* Terapia génica: En algunos casos, los plásmidos recombinantes que contienen genes terapéuticos pueden usarse para administrar genes correctivos a las células en la terapia génica.
nota: Los detalles específicos del proceso pueden variar según el gen clonado, el huésped bacteriano y la aplicación deseada.
