En biología molecular, la buena elección del tampón y la preparación para diferentes pasos de aislamiento de ADN pueden ser la diferencia entre pasar a la expresión de proteínas o abrir otro kit maxi-prep para comenzar de nuevo. A pesar de su importancia crucial, las recetas intermedias son a menudo solo eso: recetas escritas sin explicación o justificación para los diferentes componentes. Uno de esos tampones es el glucosa-tris-EDTA o GTE.
¿Para qué se usa GTE?
GTE se usa para resuspender los sedimentos de células bacterianas antes de lisar (romper) las células y recolectar el ADN plasmídico. dentro. La lisozima, que suaviza las membranas celulares, a menudo se agrega junto con el tampón GTE. Lograr una suspensión homogénea de células enteras durante este paso para que la solución de lisis añadida posteriormente pueda llegar a todas las células es clave para obtener buenos rendimientos de ADN. GTE está diseñado para hacer esto y al mismo tiempo proporciona un entorno estable para el ADN.
Glucosa para osmolaridad
Se agrega azúcar de glucosa 50 mM (milimolar) al tampón GTE para mantener la osmolaridad donde la concentración de soluto fuera de las células cerca de eso dentro de las celdas. Esto evita la lisis celular prematura, que puede causar rendimientos de ADN más bajos debido a la agregación y degradación. Los otros componentes del tampón también contribuyen a la osmolaridad de la solución, pero la glucosa, al no ser un electrolito, es una buena opción porque no interfiere con las propiedades del tampón de la solución.
Tris para la estabilidad del pH
Tris es el nombre corto de tris (hidroximetil) aminometano, que es un tampón de pH muy común. En el caso del tampón GTE, la sal ácida (Tris-HCl) se agrega al tampón a una concentración de 25 mM. Esto mantiene el pH de la solución a un nivel casi fisiológico de 8.0, un pH ideal para prevenir la hidrólisis ácida (degradación) del ADN plasmídico y las reacciones secundarias no deseadas de los otros componentes celulares.
El EDTA previene la degradación del ADN
El EDTA, o ácido etilendiaminotetraacético, captura o "quela" los iones metálicos fuera de la solución, evitando que participen en reacciones secundarias no deseadas. En el tampón GTE, se agrega EDTA a 10 mM. Su propósito principal es en el tampón para redondear el zinc, magnesio y calcio libres, evitando así la degradación del ADN por ciertas vías que requieren esos metales.
Algunos consejos importantes
Mantenga el tampón GTE frío y hágalo en pequeñas cantidades para evitar el crecimiento de bacterias no deseadas en el mismo. El azúcar y el pH controlado lo convierten en un gran medio de crecimiento. Siempre use agua purificada. El agua del grifo puede tener un exceso de iones metálicos de las tuberías, lo que puede abrumar la capacidad de captura del EDTA. Si sospecha la presencia de ARN interferente en su muestra, agregue RNasa A a 100 microgramos por mililitro a su tampón GTE para eliminar el problema.
