La clonación molecular es un método biotecnológico común con el que todos los estudiantes e investigadores deberían estar familiarizados. La clonación molecular utiliza un tipo de enzima llamada enzima de restricción para cortar el ADN humano en fragmentos que luego pueden insertarse en el ADN plasmídico de una célula bacteriana. Las enzimas de restricción cortan el ADN bicatenario por la mitad. Dependiendo de la enzima de restricción, el corte puede dar como resultado un extremo adhesivo o un extremo romo. Los extremos adhesivos son más útiles en la clonación molecular porque aseguran que el fragmento de ADN humano se inserta en el plásmido en la dirección correcta. El proceso de ligación, o fusión de fragmentos de ADN, requiere menos ADN cuando el ADN tiene extremos adhesivos. Finalmente, múltiples enzimas de restricción del extremo adhesivo pueden producir el mismo extremo adhesivo, incluso aunque cada enzima reconozca una secuencia de restricción diferente. Esto aumenta la probabilidad de que su región de ADN de interés pueda ser cortada por enzimas de extremos adhesivos.
Sitios de restricción y enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son enzimas que cortan secuencias específicas reconocidas en ADN bicatenario y cortar el ADN a la mitad en esa secuencia. La secuencia reconocida se llama sitio de restricción. Las enzimas de restricción se llaman endonucleasas porque cortan el ADN bicatenario, que es como normalmente existe el ADN, en lugares que se encuentran entre los extremos del ADN. Hay más de 90 enzimas de restricción diferentes. Cada uno reconoce un sitio de restricción distinto. Las enzimas de restricción dividen sus respectivos sitios de restricción 5,000 veces más eficientemente que otros sitios que no reconocen.
La orientación correcta
Las enzimas de restricción vienen en dos clases generales. Cortan el ADN en extremos pegajosos o romos. Un extremo adhesivo tiene una pequeña región de nucleótidos, los bloques de construcción del ADN, que está desapareado. Esta región sin par se llama voladizo. Se dice que el voladizo es pegajoso porque quiere y se emparejará con otro extremo adhesivo que tiene una secuencia de saliente complementaria. Las puntas adhesivas son como gemelos perdidos hace mucho tiempo que buscan abrazarse fuertemente una vez que se encuentran. Por otro lado, los extremos romos no son pegajosos porque todos los nucleótidos ya están emparejados entre las dos cadenas de ADN. La ventaja de los extremos adhesivos es que un fragmento de ADN humano solo puede caber en un plásmido bacteriano en una dirección. Por el contrario, si tanto el ADN humano como el plásmido bacteriano tienen extremos romos, el ADN humano puede insertarse cabeza a cola o cola a cabeza en el plásmido.
Extremidades adhesivas de ligadura Requiere menos ADN
Aunque el ADN con puntas es más fácil de encontrar entre sí debido a su "pegajosidad", ni las puntas adhesivas ni las puntas romas pueden fusionarse en una pieza continua de ADN. La formación de una pieza continua de ADN que está completamente ligada requiere una enzima llamada ligasa. Las ligasas conectan la columna vertebral de los nucleótidos en los extremos adherentes o romos, dando como resultado una cadena continua de nucleótidos. Debido a que los extremos pegajosos se encuentran más rápido debido a su atracción mutua, el proceso de ligación requiere menos ADN humano y menos ADN plasmídico. Es menos probable que los extremos romos del ADN y los plásmidos se encuentren entre sí, por lo que la ligadura de extremos romos requiere que se introduzca más ADN en el tubo de ensayo.
Diferentes enzimas pueden dar el mismo extremo adhesivo
Los sitios de restricción se encuentran en todo el genoma de los organismos, pero no están espaciados uniformemente. En plásmidos, pueden diseñarse para ubicarse uno al lado del otro. Los científicos que desean cortar un fragmento de ADN humano del genoma humano deben encontrar sitios de restricción que estén en el frente y en la parte posterior de la región del fragmento. Además de garantizar que un fragmento de ADN se inserta en la dirección correcta, diferentes enzimas de extremos adhesivos pueden crear el mismo extremo adhesivo aunque reconozcan secuencias de restricción diferentes. Por ejemplo, BamHI, BglII y Sau3A tienen diferentes secuencias de reconocimiento pero producen el mismo extremo adhesivo GATC. Esto aumenta la probabilidad de que haya sitios de restricción de extremos adhesivos que flanquean su gen humano de interés.
