En la electroforesis en gel, las muestras de ADN o proteínas se separan, generalmente según el tamaño, mediante la aplicación de un campo eléctrico que hace que migren a través de un gel. El uso de la electroforesis en gel es habitual en los laboratorios de investigación biomédica y se utiliza para responder una variedad de preguntas diferentes, por lo que no existe realmente una forma universal de analizar los resultados. Diferentes técnicas como Western blotting, Northern blotting y Southern blotting, por ejemplo, implican electroforesis en gel. Si está haciendo electroforesis en gel de agarosa de muestras de ADN, el tipo más común de procedimiento, por lo general necesitará hacer al menos dos cosas: 1) distinguir plásmidos sin cortar de insertos, plásmidos cortados y plásmidos cortados y 2) estimar el tamaño de los diversos fragmentos de ADN. Así es como funciona.
Verifique su libreta de laboratorio para determinar qué muestras se cargaron en cada una de ellas. Cuando cargó los pozos para su gel, debería haber notado la identidad de cada carril /muestra.
Determine qué carril contiene la "escalera" de los estándares de ADN. Estos son fragmentos de longitud conocida; su distancia de migración puede usarse para determinar el tamaño de los fragmentos de muestra.
Usando una regla, mida la distancia en su imagen desde los pocillos hasta el colorante de seguimiento, que habrá recorrido más allá que cualquiera de las bandas de ADN (En otras palabras, estará en la parte inferior del gel). Registre este número: las unidades que usa no son importantes.
Mida la distancia en su imagen desde los pocillos a cada una de las bandas en la "escalera", luego divida esa distancia por la distancia recorrida por el seguimiento de la banda de tinte. Este cálculo le da la movilidad relativa de cada banda.
Ejemplo: Supongamos que la banda de tinción de seguimiento viajó 6 pulgadas y tenemos tres bandas que viajaron 5, 4.5 y 3.5 pulgadas. ¿Cuál es su movilidad relativa? Respuesta: Dividimos 5, 4.5 y 3.5 entre 6 para obtener movilidades relativas de 0.833, 0.75 y 0.5833.
Ingrese las movilidades relativas en su programa de hoja de cálculo (Excel o cualquier otro programa similar que use) junto con el tamaño en kilobases de cada fragmento en la escalera. (El fabricante le da el tamaño de cada fragmento en las escalas que suministra, por lo que ya debería tener esta información).
Grafique los datos con la movilidad relativa en la x y el tamaño en kilobases en y.
Use la función Trendline en su programa de hoja de cálculo para ajustar una ecuación a los datos. Esta ecuación debería ser una ecuación de potencia (por ejemplo, x ^ -2) y debería ajustarse a los datos relativamente bien (coeficiente R de al menos 0,9).
Observe las bandas correspondientes a sus muestras. Recuerde que los fragmentos de ADN más pequeños viajan más lejos a través del gel que los grandes fragmentos de ADN, por lo que los más cercanos al colorante de seguimiento serán los más pequeños. Sin embargo, tenga en cuenta que si el ADN del plásmido (circular) no está cortado, se "sobrerrollará" o se retorcerá como un cable telefónico, lo que en realidad lo hará viajar MUCHO más que el ADN lineal del mismo tamaño. Del mismo modo, un plásmido "mellado" que ha sido cortado de forma incompleta viajará a una distancia MÁS CORTA que el ADN lineal del mismo tamaño. En consecuencia, no puede estimar el tamaño de plásmidos sin cortar de su gel.
Haga coincidir las bandas de cada carril con la identidad de la muestra que cargó en ese carril y determine si lo que ve es lo que esperaba . Esto dependerá de la naturaleza de tu experimento. En general, sin embargo, si digeriste un plásmido de inserción con dos enzimas de restricción, esperarías que el inserto se liberase del plásmido; dado que es mucho más pequeño que el plásmido, esperaría ver dos bandas en ese carril, una cerca de la parte superior y la otra cerca del final. Un corte de plásmido con una sola enzima de restricción debe formar una sola banda que se desplaza un poco más lejos que el plásmido cortado con dos enzimas de restricción, pero no tan lejos como el inserto.
Mida la distancia desde los pocillos a cortar el plásmido e insertar bandas con su regla. Divida estos números por la distancia recorrida por el colorante de seguimiento para encontrar la movilidad relativa de los insertos y plásmidos cortados.
Conecte la movilidad relativa de los insertos y corte los plásmidos en la ecuación que su programa de hoja de cálculo calculó para usted. Este cálculo debería darle una estimación del tamaño de estos plásmidos.
Consejo
Si ve bandas brillantes y anchas en el fondo de cada carril, probablemente tenga algo de ARN en su gel - su protocolo de purificación puede ser defectuoso.
