Cuantifique su muestra de ARN midiendo su absorbancia de luz ultravioleta (UV). Un espectrofotómetro de nano-caída utilizará solo uno o dos microlitros de su muestra, que puede recuperar. Otros espectrofotómetros requieren una muestra mucho más grande. El coeficiente de extinción para nucleótidos a una longitud de onda UV de 260 nm en una trayectoria de luz de 1 cm es 20. En base a este coeficiente de extinción, la absorbancia de 40 μg /ml de ARN en las mismas condiciones es una. Usando esta información, puede calcular la concentración de su muestra de ARN.

Efectúe una dilución, si es necesario, de su muestra. Una dilución estándar para una microcubeta es 1:40. Haga esta dilución agregando 2μL de muestra de ARN a 78μL de agua estéril.

Siga los protocolos de su espectrofotómetro específico para calibrar la máquina usando un blanco y luego determine la densidad óptica de su muestra a una longitud de onda UV de 260nm.

Multiplique la absorbancia de su muestra por su factor de dilución en 40 μg de ARN /ml. La ecuación sería: "Concentración de ARN (μg /ml) = (OD260) x (factor de dilución) x (40 μg de ARN /ml) /(1 unidad OD260)" (Hofstra.edu) Por ejemplo: si diluyó su muestra por 1:40 y su lectura de absorbancia fue 0.08, multiplicaría 0.08 x 40 x 40 = 128 μg /ml = 0.13 μg /μL

Calcule la pureza de su muestra tomando otra lectura de absorbancia a 280nm de longitud de onda UV . La relación OD 260 /OD 280 indicará si, y en qué nivel, su muestra está contaminada con proteína o fenol. Un resultado de 1.8 a 2.0 indica ARN de calidad.

Consejo

No olvide calibrar su espectrofotómetro. Ejecutar un gel electroforético rápido confirmará los resultados de sus especificaciones.

Advertencia

No asuma que su muestra es pura. Tomarse el tiempo para obtener una relación OD260 /OD280 ahorra tiempo y dinero en el futuro.